Chương 2 .VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Các phương pháp được nghiên cứu
2.4.2. Đánh giá đa dạng di truyền các dịng nấm đạo ơn bằng chỉ thị SSR
2.4.2.1. Phương pháp tách chiết DNA
Để thu được DNA tổng số của các chủng nấm phân lập, DNA được tách chiết từ sợi nấm theo phương pháp phân giải tế bào bằng enzyme Extralyse. Phương pháp này được cung cấp từ nhóm đối tác, CIRAD, Pháp. Sovới phương pháp nghiền mẫu trong nitơ lỏng, phương pháp này rất hiệu quả và tiết kiệm công sức trong việc tách chiết DNA từ sợi nấm dựa trên việc phá vỡ thành tế bào bằng enzyme. Ngoài ra, quy trình tách chiết này còn dễ dàng thực hiện và rất phù hợp đối với các loại nấm sợi khác có đặc điểm phát triển tương tự như nấm đạo ôn M. oryzae.
Quy trình thực hiện được mơ tả ngắn gọn như sau: B1: Ủ mẫu
- Hút 1,5ml dịch chiết(easy-extract: 100 ml chứa 70ml NaCl 1M, extralyse 1,5g, pH = 6) vào ống eppendorf. Sau đó chuyển sợi nấm từ mơi trường ni dưỡng có kháng sinh vào ống.
- Ủ mẫu 1,5 giờ.
B2: Ly tâm 14.000 rpm trong 5-7 phút.
B3: Bổ sung 600 μl dung dịch đệm hòa tan tế bào đãđược đặt trong tủ nhiệt 65oC. Đệm hòa tan tế bào (100ml: 2ml Triton 100X, 5ml SDS 20%, 10ml NaCl 1M, 1ml Tris HCl pH8 10mM, 500μl EDTA 0,2M).
- Ủ mẫu 30 phút đến 1 giờ ở 65oC. B4: Tinh lọc (chloroform:isoamylalcohol 24:1)
- Bổ sung 600 μl chloroform:isoamylalcohol.
- Trộn đều bằng cách đảo ngược cho đến khi đồng nhất từ 2-3 phút.
- Ly tâm 20 phút, 14.000 rpm, T >15oC, chuyển pha lỏng ở trên sang ống eppendorf mới.
B5: Kết tủa.
- Bổ sung isopropanol lạnh với thể tích tương đương với thể tích thu được ở bước trên.
- Lắc đều bằng cách đảo ngược cho đến khi thấy sợi DNA hoặc để lạnh 1giờ hoặc qua đêm.
- Ly tâm 20 phút, 14.000 rpm.
- Đổ bỏ dịch trong, rửa bằng 400 μl cồn 70 %.
- Ly tâm 10 phút, 14.000rpm sau đó, loại bỏ cồn.
- Làm khô dưới tủ hút cho đến khi cồn bay hơi hoàn toàn (khoảng 1 giờ).
B6: Đo nồng độ DNA và pha lỗng thành nồng độ20ng/µl.
Nồng độ DNA được đo bằng máy Nanodrop (NanoDrop 8000-Thermo scientific). Nồng độ DNA và chỉ số OD là các thông số quan trọng để kiểm soát chất lượng DNA chiết được (Phụ lục 2)