CHƢƠNG 2 : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.4. Phương pháp kháng sinh đồ cho 5 thuốc chống lao hàng một
Việc thực hiện kháng sinh đồ cho 5 thuốc chống lao hàng một được thực hiện bằng 02 phương pháp: kháng sinh đồ trên môi trường lỏng được thực hiện cho Pyrazinamid (PZA), kháng sinh đồ trên môi trường đặc được thực hiện cho 4 thuốc chống lao còn lại là Rifampicin (RMP), Isoniazid (INH), Ethambutol (EMB), Streptomycin (SM). Quá trình làm kháng sinh đồ được thực hiện trong phịng an tồn sinh học có áp lực âm và tủ an tồn sinh học cấp độ II, theo quy trình chuẩn của Labo Lao chuẩn quốc gia tại Bệnh viện Phổi Trung ương.
2.3.4.1. Phương pháp xác định tính kháng Pyrazinamide (PZA) trên mơi trường lỏng
Nguyên lý: Hệ thống BACTEC MGIT 960 được dùng làm thử nghiệm kháng sinh đồ PZA. Dựa trên chỉ số growth unit (GU), hệ thống tự động so sánh lượng vi khuẩn mọc ở ống chứa thuốc kháng sinh với ống chứng không chứa thuốc kháng sinh, máy tự động phân tích kết quả. Chủng vi khuẩn thử nghiệm được pha theo tỷ lệ quy định, cấy vào mơi trường lỏng MGIT khơng có và có PZA và đưa vào hệ thống nuôi cấy. Hệ thống sẽ giám sát liên tục sự phát phát quang của ống cấy dựa trên đơn vị sinh trưởng GU. Kết quả kháng sinh đồ được báo cáo trong vòng 4- 21 ngày khi ống chứng đạt 400 GU, dựa trên so sánh định lượng sự phát triển của vi khuẩn lao trong ống chứng và ống có thuốc PZA. Ống có thuốc PZA GU < 100 là nhạy cảm; GU > 100 là kháng thuốc. Mỗi mẻ kháng sinh đồ trong ngày với cùng lơ hóa chất được kiểm tra chất lượng bằng chủng chuẩn H37RV 100 và được thực hiện như chủng thử nghiệm.
Các bƣớc tiến hành
Chuẩn bị môi trường: Chuẩn bị 02 ống (ống chứng và ống thử nghiệm) chứa MGIT960 PZA có bổ sung 0,8ml yếu tố sinh trưởng, ghi đầy đủ thông tin bệnh nhân và ngày xét nghiệm lên ống. Pha PZA 8000µg/ml trong 2.5 ml nước cất vơ trùng. Lấy 100 µl PZA bổ sung vào ống MGIT thử nghiệm.
Chuẩn bị chủng làm kháng sinh đồ: Các chủng làm kháng sinh đồ được kiểm tra là chủng thuần. Huyền dịch vi khuẩn được chuẩn bị bằng cách gặt chủng cho vào ống có bi thủy tinh vơ trùng và vài giọt nước cất, voltex trong 2-3 phút để chủng được hịa tan hồn tồn, ủ 15 phút sau đó thêm nước cất trộn đều, điều chỉnh huyền dịch có độ đục hơn chuẩn Mac Farland 1.0. Sau 20 phút, chuyển phần
nước nổi sang ống vô trùng khác. Thêm nước cất, điều chỉnh huyền dịch có độ đục tương đương độ đục chuẩn Mc Farland 0.5. Pha tiếp huyền dịch với nước cất tỷ lệ 1:5, dùng huyền dịch này làm kháng sinh đồ. Lấy 1ml huyền dịch đã pha loãng 1:5 ở bước trên tiếp tục pha loãng với nước cất tỷ lệ 1:10 để được huyền dịch cấy vào ống MGIT960 PZA làm ống chứng GC.
Cấy huyền dịch vi khuẩn vào môi trường kháng sinh đồ: Dùng Pipet tự động hút 0,5ml huyền dịch chuẩn bị cho ống GC vào ống chứng GC. Dùng Pipet tự động húy 0,5ml huyền dịch pha loãng tỷ lệ 1:5 vào ống thử nghiệm PZA. Vặn chặt nắp mỗi ống và đảo ngược ống 3-4 lần để đồng nhất dung dịch. Xếp 2 ống vào giá code AST theo đúng thứ tự: GC-PZA. Đưa giá code AST vào máy BACTEC MGIT960 và ghi các thông tin vào sổ kháng sinh đồ.
Đọc kết quả kháng sinh đồ: Máy báo kết quả kháng sinh đồ tại thời điểm ống chứng GC đạt 400GU trong vòng 4-21 ngày. Ngưỡng kháng là 100GU. Kết quả kháng sinh đồ có thể được thơng báo một trong ba trường hợp:
+ Kết quả nhạy (S): ống thử nghiệm PZA có mức GU < 100 + Kết quả kháng (R): ống thử nghiệm PZA có mức GU > 100
+ Kết quả khơng kết luận được (X) báo lỗi: ống thử nghiệm GU >400 và thời gian máy báo < 4 ngày có thể do pha huyền dịch đặc hoặc chủng nhiễm trùng; lỗi GU<200 có thể do một số chủng kháng thuốc đặc hiệu mọc chậm hoặc huyền dịch vi khuẩn quá loãng. Trong trường hợp này kiểm tra lại các bước và thực hiện lại kháng sinh đồ.
2.3.4.2. Phương pháp xác định tính kháng INH; RMP; SM; EMB trên môi trường đặc
Nguyên lý phƣơng pháp kháng sinh đồ tỷ lệ: Xác định tỷ lệ phần trăm số
lượng khuẩn lạc vi khuẩn lao mọc trên mơi trường có chứa các loại thuốc chống lao ở nồng độ tối thiểu so với số vi khuẩn lao mọc trên môi trường đối chứng không chứa thuốc. Xác định sự kháng của vi khuẩn lao với từng loại thuốc bằng cách so sánh tỷ lệ trên với ngưỡng kháng. Nếu trên hoặc bằng ngưỡng là vi khuẩn kháng; dưới ngưỡng là vi khuẩn nhạy cảm. Nồng độ thuốc và ngưỡng kháng thuốc chống lao được trình bày ở bảng 2.2. Mỗi mẻ kháng sinh đồ trong ngày được làm cùng 03 chủng kiểm tra, cách thức làm giống như chủng thử nghiệm: Chủng chuẩn H37RV 100; chủng chứng kháng RS (kháng RMP và SM), chủng chứng kháng HE (INH và EMB).
Bảng 2.2: Nồng độ thuốc và ngƣỡng kháng thuốc kháng lao hàng 1 trên môi trƣờng đặc
Tên thuốc Nồng độ thuốc µg/ml Ngƣỡng kháng (%)
Isoniazid 0.2 1
Streptomycin 4.0 1
Rifampicin 49.0 1
Ethambutol 2.0 1
Các bƣớc tiến hành
Chuẩn bị môi trường: Chuẩn bị dung dịch Malachite green 2%, dung dịch
LJ cơ bản, dung dịch trứng. Ở bảng 2.3, thuốc dạng bột được tính tốn để pha trong nước cất vô trùng hoặc trong propylene tùy loại thuốc tạo thành dung dịch thuốc (1). Sau đó dung dịch thuốc (1) sẽ được pha tiếp với nước cất vô trùng để tạo thành những dung dịch có nồng độ thấp hơn rồi bổ sung vào mơi trường LJ với thể tích phù hợp để đạt được nồng độ thuốc cuối cùng trong mơi trường là 0,2 µg/ml cho INH; 40 µg/ml cho RMP; 4 µg/ml cho SM; 2 µg/ml cho EMB, 500 µg/ml cho PNB (Para nitrobenzoic acid) (ống đối chứng kiểm tra chủng xác định MTB).
Bảng 2.3: Hƣớng dẫn pha dung dịch thuốc (1)
Số mg thuốc mỗi loại tính theo độ tinh khiết
Hịa tan trong Dung dịch thuốc (1)
10 ml nước cất vô trùng Dung dịch INH (1) 2 ml dung môi Propylen
8 ml nước cất vô
trùng
Dung dịch RMP (1)
10 ml nước cất vô trùng Dung dịch SM (1) 10 ml nước cất vô trùng Dung dịch EMB (1) 20 ml dung môi
Propylen
Dung dịch PNB (1)
Mỗi chủng thử nghiệm chuẩn bị: 04 ống môi trường LJ (2 ống ghi 10-2; 2 ống ghi 10-4); 04 ống mơi trường LJ có chứa kháng sinh (INH, RMP, SM, EMB) và ống PNB. Ghi rõ các thông tin ký hiệu chủng, ngày thực hiện trên các ống.
Các chủng làm kháng sinh đồ được kiểm tra là chủng thuần đã được định danh; chủng nguyên thủy 3-4 tuần tuổi có nhiều hơn 5 khuẩn lạc; chủng cấy truyền 2 tuần tuổi.
Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn: Dùng ăng nhựa lấy vi khuẩn lao từ ống
ni cấy cho vào ống có bi thủy tinh vô trùng và vài giọt nước cất. Voltex trong 2- 3 phút để chủng được hịa tan hồn tồn. Chờ 15 phút. Thêm 2-4 ml nước cất vô trùng trộn đều để 15 phút. Dùng pipet vô trùng hút huyền dịch phía trên nhỏ dần vào ống chứa 10ml nước cất vô trùng, trộn đều, điều chỉnh huyền dịch độ đục tương đương Mac Farland 1.0. Ta được huyền dịch nồng độ 100
. Pha 100 µl huyền dịch 100 và ống chứa 99ml nước cất vô trùng, trộn đều được nồng độ 10-2, tiếp tục pha loãng trong nước cất để thu được nồng độ 10-4
. Huyền dịch 10-2 và 10-4 được sử dụng để làm kháng sinh đồ
Cấy chủng làm kháng sinh đồ: Dùng pipet vô trùng cấy vào ống mơi
trường có kháng sinh 0,1 ml huyền dịch vi khuẩn 10-4, nhẹ nhàng láng đều huyền dịch trên ống môi trường chứa kháng sinh. Hai ống LJ không chứa kháng sinh cấy huyền dịch vi khuẩn 10-4; 2 ống LJ không chứa kháng sinh khác cấy huyền dịch vi khuẩn 10-2. Sau đó, vặn lỏng nắp ống mơi trường, đặt ống cấy lên khay, mặt môi trường quay lên trên, đặt khay vào tủ ấm 370
C. Kiểm tra ngoại nhiễm sau khi ủ ấm 24 giờ, 72 giờ, 1 tuần và vặn nắp ống khi mặt môi trường đã khô và tiếp tục cho vào tủ ấm.
Hình 2.4: Chuẩn bị huyền dịch làm kháng sinh đồ đặc
Đọc kết quả kháng sinh đồ: Đánh giá kết quả ở 2 thời điểm là sau 28 ngày
và 42 ngày nuôi cấy. Chủng chuẩn H37RV nhạy với các thuốc kháng lao; Chủng chứng kháng RS: kháng với Rifampicin và Streptomycin; Chủng chứng kháng HE: Kháng với Isoniazid và Ethamtanol; Các ống mơi trường LJ 10-2 phải có số khuẩn lạc > 200 khuẩn lạc; Các ống môi trường LJ 10-4 phải có khuẩn lạc; Ống PNB khơng có khuẩn lạc, nếu mẫu nào có khuẩn lạc thì cần phải kiểm tra lại định danh chủng thử nghiệm.
Đánh giá kết quả vi khuẩn mọc: Đánh giá trên tất cả 9 ống môi trường cụ thể như sau:
Bảng 2.4: Đánh giá kết quả vi khuẩn mọc dựa vào khuẩn lạc
Đặc điểm Kết quả
Khơng thấy khuẩn lạc Âm tính
< 20 khuẩn lạc Dương tính: ghi cụ thể số khuẩn lạc 20 - 100 khuẩn lạc Dương tính: 1+
100 - 200 khuẩn lạc Dương tính: 2+ 200 - 500 khuẩn lạc Dương tính: 3+ >500 khuẩn lạc Dương tính: 4+
Nhiễm trùng hoặc nấm Ngoại nhiễm
Nhận định kết quả kháng thuốc: So sánh số lượng khuẩn lạc trên ống mơi trường LJ có thuốc và ống mơi trường khơng có thuốc LJ 10-4. Tỷ lệ 1% được gọi là ngưỡng kháng.
Tuỳ thuộc kết quả so sánh để đánh giá tính kháng thuốc của vi khuẩn lao theo các trường hợp như bảng 2.5:
Bảng 2.5: Đánh giá tính kháng thuốc của vi khuẩn lao Kết qủa vi khuẩn mọc Kết qủa vi khuẩn mọc trên ống thuốc Ngày thứ 28 Ngày thứ 42 Kết luận tính kháng
Khuẩn lạc không mọc trên môi trường chứa thuốc
Kết quả sơ bộ: nhạy cảm
Ủ ấm tiếp Nhạy cảm Nhạy cảm
Tỷ lệ phần trăm khuẩn lạc lớn hơn hoặc bằng ngưỡng kháng Kháng Trả kết quả Kháng Tỷ lệ phần trăm số khuẩn lạc nhỏ hơn ngưỡng kháng Kết quả chưa rõ ràng
Ủ ấm tiếp Nhạy cảm Nhạy cảm
Làm lại kháng sinh đồ sớm nhất có thể trong các trường hợp: vi khuẩn không mọc trên ống chứng; số lượng khuẩn lạc trên ống môi trường LJ 10-2 < 200 khuẩn lạc; tỷ lệ kháng xấp xỉ ngưỡng kháng; ngoại nhiễm. Các trường hợp ngoại nhiễm hoặc lẫn vi khuẩn ngoài lao sẽ được phát hiện trong khoảng thời gian một tuần sau khi thực hiện cấy kháng sinh đồ.