Thuốc Sự mẫn cảm với thuốc Thể lao Xác suất Lao mới (n=69) Lao tái trị (n=56) P INH Nhạy (n, %) 58 (84,1%) 32 (57,1%) χ2=11,108 Kháng (n, %) 11 (15,9%) 24 (42,9%) p=0,001 RIF Nhạy (n, %) 68 (98,6%) 51 (91,1%) χ2=3,784 Kháng (n, %) 1 (1,4%) 5 (8,9%) p=0,089 SM Nhạy (n, %) 60 (87,0%) 31 (72,8%) χ2=15,588 Kháng (n, %) 9 (13,0%) 25 (44,6%) p=0,000 EMB Nhạy (n, %) 68 (98,6%) 51 (91,1) χ2=3,784 Kháng (n, %) 1 (1,4%) 5 (8,9%) p=0,089 PZA Nhạy (n, %) 68 (98,6%) 52 (92,9%) χ2=2,610 Kháng (n, %) 1 (1,4%) 4 (7,1%) p=0,172 Đa kháng (RIF và INH) Nhạy (119; 95,2 %) 68 (98,6%) 51(91,1%) χ2=3,784 p=0,089 Kháng (6; 4,8%) 1 (1,4%) 5 (8,9%)
Có sự khác biệt rõ rệt và mang tính thống kê về tỷ lệ nhạy/kháng INH và SM giữa hai nhóm lao phổi mới và lao phổi tái trị (p< 0.05) Tỷ lệ kháng INH ở nhóm lao phổi tái trị là 42,9% và ở nhóm lao phổi mới là 15,9%. Tỷ lệ kháng RMP, EMB, PZA ở hai nhóm lao phổi mới và lao phổi tái trị khơng có sự khác biệt (p>0.05). Tỷ lệ kháng RMP, kháng EMB ở lao phổi mới là 1,4%; ở nhóm lao phổi tái trị là 8,9%. Tỷ lệ kháng PZA ở lao phổi mới là 1,4%; ở nhóm lao phổi tái trị là 7,1%. Tỷ lệ đa kháng chung trong nghiên cứu này là 4,8 % (6 trường hợp) và cũng khơng có sự khác biệt rõ ở cả hai nhóm lao phổi mới (1,4%) và lao phổi tái trị (8,9%).
Điều tra kháng thuốc lần 4 của chương trình chống lao quốc gia (2011-2012), tỷ lệ đa kháng thuốc chung là 4%, nhóm tái trị là 23,3% [16]. Và theo thống kê báo cáo mới nhất của WHO (2018) năm 2017 tỷ lệ đa kháng thuốc ước tính tại Việt Nam ở bệnh nhân mới là 4,1% và bệnh nhân tái phát là 17%. Như vậy, tỷ lệ đa kháng ở nhóm lao tái trị trong nghiên cứu này thấp hơn nhiều so với tỷ lệ theo điều tra kháng thuốc toàn quốc lần thứ 4 cũng như báo cáo mới nhất của WHO (2018) và một số nghiên cứu trong, ngồi nước khác [4]. Điều này có thể giải thích do nhóm bệnh nhân lao phổi trong nghiên cứu này đã được loại trừ các trường hợp kháng RIF bằng xét nghiệm GeneXpert MTB/RIF. Tuy tỷ lệ đa kháng ở nhóm lao phổi tái trị (8,9%) cao hơn so với nhóm lao phổi mới nhưng sự khác biệt này khơng có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Như vậy kể cả những bệnh nhân lao phổi mới thì vẫn có nguy cơ cao nhiễm vỉ khuẩn lao đa kháng. Vì thế việc loại trừ nhanh lao đa kháng bằng GeneXpert nên được triển khai rộng rãi cả ở bệnh nhân lao mới. Theo thống kê của WHO năm 2017 mới chỉ có 32% bệnh nhân lao mới và 67% bệnh nhân lao tái trị được thực test kháng Rifampicin
Trong 5 loại thuốc kháng lao hàng một, tỷ lệ kháng thuốc cao nhất là SM (44,6%) và tiếp theo là INH (42,9%) trên nhóm lao phổi tái trị. Từ năm 1996-1997, khi Việt Nam thực hiện điều tra kháng thuốc thuốc tồn quốc lần 1 thì tỷ lệ kháng INH là 20%; kháng SM là 24%. Đến lần điều tra thứ 4 năm 2011-2012 tỷ lệ này trên bệnh nhân tái trị là 43,5% kháng INH và 50,7% kháng SM [14]. Như vậy tỷ lệ
kháng SM và INH trên bệnh nhân tái trị của nghiên cứu thấp hơn so với điều tra kháng thuốc gần đây và một số nghiên cứu trong nước khác (kháng SM là 79,5%, kháng INH là 82,2% [6] nhưng lại cao hơn so với các tác giả nước ngoài [28]. Ngoài yếu tố nhạy cảm khác nhau với từng loại thuốc, tỷ lệ này cịn có thể do trước đây theo hướng dẫn của Bộ Y tế, phác đồ điều trị cho bệnh nhân, đặc biệt là bệnh nhân tái điều trị có sử dụng SM[17]. SM là một thuốc chống lao hàng một dạng tiêm, bệnh nhân phải đến các cơ sở y tế để thực hiện, nên trong q trình tn thủ có thể khơng được thực hiện tốt, tạo điều kiện cho vi khuẩn kháng thuốc được biểu hiện làm tăng tính kháng thuốc trong quần thể. Trong 2 năm trở lại đây SM đã được đưa ra khỏi các phác đồ điều trị chính, chỉ sử dụng trong các trường hợp đặc biệt.
Cùng với SM, tỷ lệ kháng INH trong nhóm lao phổi tái trị của nghiên cứu thấp hơn so với nhiều nghiên cứu trong nước khác [4]. Đây có thể là kết quả của những nỗ lực làm giảm tỷ lệ kháng thuốc trong chương trình chống lao quốc gia. Nhưng tỷ lệ kháng của INH vẫn thuộc mức cao và cao hơn so với thể giới [28], và có tỷ lệ cao hơn nhiều lần giữa nhóm lao phổi tái trị và lao phổi mới. Vì vậy cần phải có các biện pháp giám sát chặt chẽ trong việc sử dụng điều trị INH, để đảm bảo INH vẫn là nguồn thuốc tốt trong điều trị lao, dự phòng lao.
Trong nghiên cứu này, không phát hiện được trường hợp kháng RMP đơn độc. Tất cả các trường hợp kháng RMP đều kháng INH (2,4%, 6/125). Một số nghiên cứu trong nước cho thấy phần lớn (89,95%) các chủng kháng RMP thường kháng phối hợp Isoniazid [6]. Theo Nguyễn Thị Thu Thái (2017) nghiên cứu trên 700 bệnh nhân tại 3 bệnh viện lớn trên toàn quốc cũng chỉ phát hiện 3 chủng vi khuẩn lao đơn kháng RMP [19]. Báo cáo năm 2018 của WHO cũng cho thấy trong số 558.000 kháng RMP thì có 82% kháng RMP kết hợp INH (đa kháng thuốc). Trong nghiên cứu của chúng tôi 100% chủng kháng RMP kháng kết hợp Isoniazid (chủng đa kháng MDR-TB).
125 bệnh nhân tham gia nghiên cứu đã được loại trừ kháng RMP bằng xét nghiệm nhanh GeneXpert MTB/RF và có kết quả MTB+/RIF-. Tuy nhiên xét
nghiệm tính kháng RMP của các chủng này bằng phương pháp kháng sinh đồ tỷ lệ, chúng tôi đã phát hiện được 6 trường hợp kháng RMP. Như vậy, theo khuyến cáo của WHO cũng như của Bộ Y tế, GeneXpert MTB/RIF có thể được dùng để sàng lọc chuẩn đốn nhanh tình hình kháng RMP. Nhưng trong q trình điều trị nếu có nghi ngờ hoặc điều kiện cho phép thì vẫn nên kiểm tra lại bằng kháng sinh đồ.
Đối với tính kháng EMB, chúng tơi khơng phát hiện được trường hợp kháng EMB đơn độc. Tỷ lệ kháng EMB ở cả hai nhóm là 4,8%. Tỷ lệ kháng EMB ở nhóm lao mới là 1,4% khơng có khác biệt lớn với tỷ lệ 1,1% trong điều tra kháng thuốc lần thứ nhất năm 1996. Tuy nhiên theo Mai Văn Tuấn (2016) trên nghiên cứu 214 bệnh nhân lao tại bệnh viện Thừa Thiên Huế tỷ lệ kháng EMB lên đến 7,9%[20]. Tính kháng của EMB ít được quan tâm tại Việt Nam một mặt vì sự khơng ổn định trong xét nghiệm kháng sinh đồ đối với EMB [58], mặt khác mọi nguồn lực được tập trung vào lao đa kháng. Tuy nhiên, hiện nay đã có nhiều bằng chứng cho thấy tính kháng EMB có liên quan chặt chẽ với tính đa kháng MDR-TB [58], [38]. Trong nghiên cứu này, 6 chủng vi khuẩn kháng EMB cũng là những chủng đa kháng MDR-TB. Vì vậy, cần phải có những thống kê, nghiên cứu về tính kháng EMB phục vụ cho giám sát, đánh giá điều trị lao, đặc biệt là lao kháng thuốc khi EMB là 1 trong những thuốc của phác đồ chuẩn điều trị lao đa kháng [18].
Khác với EMB, tính kháng PZA của vi khuẩn lao ít được quan tâm vì sự phức tạp trong thực hiện xét nghiệm kháng sinh đồ truyền thống. Tại Việt Nam, gần như khơng có các báo cáo về tình hình kháng PZA. Các xét nghiệm chỉ định kháng sinh đồ cho bệnh nhân cũng như các nghiên cứu ít thực hiện với PZA vì xét nghiệm kháng sinh đồ PZA tương đối phức tạp so với kháng sinh đồ đặc các thuốc kháng lao hàng một khác [38]. Trong năm 2010-2011, Bệnh viện Phổi Trung ương và bệnh viện Phạm Ngọc Thạch đã thực hiện nghiên cứu tính kháng PZA trên 1533 chủng
M.tuberculosis phân lập từ 1398 bệnh nhân lao phổi mới và 135 bệnh nhân lao phổi
tái trị. Kết quả cho thấy tỷ lệ kháng PZA là 2,2% (33/1533), trong đó tỷ lệ ở bệnh nhân lao phổi mới là 1,8% (25/1398) và ở bệnh nhân lao tái trị là 5,9% (8/135). 100%
các chủng kháng PZA có kháng phối với hợp với các thuốc kháng lao hàng một, trong đó 100% các chủng vi khuẩn kháng PZA phân lập từ nhóm bệnh nhân tái trị là các chủng đa kháng; tỷ lệ này ở nhóm bệnh nhân lao phổi mới là 60% [35]. Kết qủa này phù hợp với kết quả trong các nghiên cứu tương tự của các nhà khoa học trên thế giới[49]. Trong nghiên cứu của chúng tôi tỷ lệ kháng PZA trên nhóm lao phổi mới và lao phổi tái trị lần lượt là 1,4% và 7,1%. Tỷ lệ kháng PZA trên nhóm lao phổi tái trị cao hơn so với nghiên cứu năm 2011. Và 100% chủng PZA ở nhóm lao phổi tái trị cũng là chủng đa kháng. Ở nhóm lao phổi mới, trong nghiên cứu của chúng tơi khơng có đối tượng đa kháng nên có sự sai khác so với nghiên cứu năm 2011. Như vậy có thể thấy, tính kháng PZA đã có xu hướng gia tăng ở nhóm lao tái trị. PZA vẫn đang là một trong những thuốc nền tảng trong phác đồ điều trị lao đa kháng và hiện nay kháng sinh đồ PZA có thể được thực hiện bằng dạng kháng sinh đồ lỏng với kít thương mại MGIT 960 PZA. Vì vậy cần phải có các biện pháp số liệu giám sát tính kháng PZA thường xuyên hơn để kịp thời có những điều chỉnh thích hợp trong q trình điều trị và kế hoạch phịng chống kháng thuốc.
3.2. Tỷ lệ phân bố các kiểu gen NAT2 trên ngƣời bệnh lao và mối ảnh hƣởng đến tính kháng thuốc Isoniazid
3.2.1. Kết quả tối ưu quy trình phân tích NAT2
Các mẫu máu thu được từ 125 bệnh nhân được tách DNA theo kit của Omega, sản phẩm tách chiết điện di trên gel agarose 1,2%. Kết quả điện di sản phẩm DNA tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân (Hình 3.3) cho thấy các sản
phẩm DNA tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân đều có một băng DNA rõ nét, chất lượng DNA từ các mẫu khác nhau tương đối đồng đều và ổn định, thể hiện qua các băng điện di có độ sáng cao tương ứng với băng 23,1 kb của thang chuẩn.
Làn M1: thang chuẩn DNA λ/HindIII; Làn 1 - 16: sản phẩm DNA tổng số của mẫu
23,1kb
Hình 3.3: Kết quả DNA tổng số tách chiết điện di trên gel agarose 1,2%.
Kết quả đo mật độ hấp thụ quang ở 260 nm của sản phẩm DNA tổng số cho thấy nồng độ DNA thu được dao động từ 20 - 200 ng/µL, chỉ số A260/A280 nằm trong khoảng từ 1,6 đến 2,2. Như vậy, DNA tổng số thu được ít bị đứt gãy với một băng duy nhất, đảm bảo tinh sạch và đủ điều kiện để tiến hành phản ứng nhân dịng tiếp theo. Chúng tơi lựa chọn Kapa2GTM Robust Hotstart Ready Mix với ưu điểm là khả năng khuếch đại gen dù có hiện diện của một số chất ức chế PCR hoặc với các mẫu DNA có độ tinh sạch thấp. Hình 3.4 là kết quả điện di nhân dịng gen NAT2.
Hình ảnh là một băng sáng rõ nét cho thấy phản ứng PCR đạt hiệu suất và độ đặc hiệu cao, đảm bảo điều kiện cho phân tích giải trình tự tiếp theo.
Làn M: O Gene Ruler Ladder DNA marker, Làn (-): đối chứng âm
Làn M: Massruler Express Forward DNA Ladder Mix, Làn (-): đối chứng âm
Hình 3.4: Kết quả nhân dòng gen NAT2 của một số mẫu theo điều kiện tối ƣu
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Base pair 23,130 9,416 6,557 4,361 2,322 2,027
Sản phẩm nhân dòng gen NAT2 từ phản ứng PCR ở trên được tinh sạch và giải trình tự. Kết quả giải trình tự được trình bày ở hình 3.5 cho thấy các pick đại diện cho các nucleotide có độ phân giải tốt, khơng bị nhiễu giúp dễ dàng phân tích kết quả. Hình 3.5 cho thấy tất cả các kiểu gen tổ hợp của các allen kiểu dại (*4) và các allen khác (*5, *6, *7) đều xuất hiện trong nghiên cứu này.
KG Đồng hợp kiểu dại (NAT2*4*4) Dị hợp đa hình alen (NAT2*4*5/*4*6/*4*7 /*5*6/*5*7/*6*7) Đồng hợp đa hình alen (NAT2*5*5/*6*6/*7*7) NAT2 *5 TT CT CC NAT2 *6 GG GA AA NAT2 *7 GG GA AA
* NAT2*4 là kiểu gen khơng chứa các đa hình alen
Hình 3.5: Kết quả đọc kiểu gen NAT2
3.2.2. Tỷ lệ phân bố các kiểu gen NAT2 trên người bệnh lao
N-Acetyltransferase 2 đóng vai trị quan trọng trong chuyển hóa của nhiều loại thuốc và các hợp chất ngoại lai. Hiện nay, thông tin về sự phân bố của các dạng đa hình gen NAT2 đã được tiến hành nghiên cứu tại nhiều quốc gia trên thế
giới. Phần lớn các nghiên cứu xác định sự phân bố của các alen NAT2 đã được đơn giản hóa bằng cách chỉ phân tích đối với một số vị trí đa hình làm thay đổi chức năng NAT2 như NAT2*5, *6, *7 trong tổng số 27 đa hình đơn nucleotide được tìm
thấy ở NAT2. Đa hình trong NAT2 chịu trách nhiệm về tính đa hình N-acetyl hóa, trên thế giới được chia thành các dạng acetyl hóa nhanh, trung bình và chậm. Sự