Đọc kết quả kháng sinh đồ: Đánh giá kết quả ở 2 thời điểm là sau 28 ngày
và 42 ngày nuôi cấy. Chủng chuẩn H37RV nhạy với các thuốc kháng lao; Chủng chứng kháng RS: kháng với Rifampicin và Streptomycin; Chủng chứng kháng HE: Kháng với Isoniazid và Ethamtanol; Các ống môi trường LJ 10-2 phải có số khuẩn lạc > 200 khuẩn lạc; Các ống môi trường LJ 10-4 phải có khuẩn lạc; Ống PNB khơng có khuẩn lạc, nếu mẫu nào có khuẩn lạc thì cần phải kiểm tra lại định danh chủng thử nghiệm.
Đánh giá kết quả vi khuẩn mọc: Đánh giá trên tất cả 9 ống môi trường cụ thể như sau:
Bảng 2.4: Đánh giá kết quả vi khuẩn mọc dựa vào khuẩn lạc
Đặc điểm Kết quả
Không thấy khuẩn lạc Âm tính
< 20 khuẩn lạc Dương tính: ghi cụ thể số khuẩn lạc 20 - 100 khuẩn lạc Dương tính: 1+
100 - 200 khuẩn lạc Dương tính: 2+ 200 - 500 khuẩn lạc Dương tính: 3+ >500 khuẩn lạc Dương tính: 4+
Nhiễm trùng hoặc nấm Ngoại nhiễm
Nhận định kết quả kháng thuốc: So sánh số lượng khuẩn lạc trên ống mơi trường LJ có thuốc và ống mơi trường khơng có thuốc LJ 10-4. Tỷ lệ 1% được gọi là ngưỡng kháng.
Tuỳ thuộc kết quả so sánh để đánh giá tính kháng thuốc của vi khuẩn lao theo các trường hợp như bảng 2.5:
Bảng 2.5: Đánh giá tính kháng thuốc của vi khuẩn lao Kết qủa vi khuẩn mọc Kết qủa vi khuẩn mọc trên ống thuốc Ngày thứ 28 Ngày thứ 42 Kết luận tính kháng
Khuẩn lạc khơng mọc trên môi trường chứa thuốc
Kết quả sơ bộ: nhạy cảm
Ủ ấm tiếp Nhạy cảm Nhạy cảm
Tỷ lệ phần trăm khuẩn lạc lớn hơn hoặc bằng ngưỡng kháng Kháng Trả kết quả Kháng Tỷ lệ phần trăm số khuẩn lạc nhỏ hơn ngưỡng kháng Kết quả chưa rõ ràng
Ủ ấm tiếp Nhạy cảm Nhạy cảm
Làm lại kháng sinh đồ sớm nhất có thể trong các trường hợp: vi khuẩn không mọc trên ống chứng; số lượng khuẩn lạc trên ống môi trường LJ 10-2 < 200 khuẩn lạc; tỷ lệ kháng xấp xỉ ngưỡng kháng; ngoại nhiễm. Các trường hợp ngoại nhiễm hoặc lẫn vi khuẩn ngoài lao sẽ được phát hiện trong khoảng thời gian một tuần sau khi thực hiện cấy kháng sinh đồ.
2.3.5. Phân tích kiểu gen NAT2 để xác định kiểu hình acetyl hóa isoniazid
Thu thập, vận chuyển và bảo quản mẫu máu
Những bệnh nhân đủ tiêu chuẩn đáp ứng 5 tiêu chuẩn đầu tiên trong mục 2.2.1 sẽ được lấy mẫu máu cho phân tích gen NAT2 vào ngày điều trị thứ 10 -14. Mỗi bệnh nhân được lấy 2ml máu tĩnh mạch vào ống có chất chống đơng EDTA ghi đầy đủ thơng tin gồm mã bệnh nhân, tên, tuổi, ngày lấy mẫu. Mẫu được vận chuyển bằng hộp giữ lạnh đựng mẫu chuyên dụng về phịng thí nghiệm Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội bảo quản ở -300
C cho đến khi thực hiện các bước tiếp theo.
Tách chiết, kiểm tra và định lƣợng ADN
ADN được tách chiết theo hướng dẫn của nhà sản xuất, sử dụng kit E.Z.N.A blood DNA Mini (Mỹ). Nồng độ và độ tinh sạch của DNA tách chiết được định lượng bằng máy đo Nano Photometer-implen NP80: đo mật độ hấp thụ quang ở bước sóng 260 nm (A260) và 280 nm (A280). DNA được cho là có độ tinh sạch cao khi giá trị A260/A280 nằm trong khoảng 1,8 - 2,0. Chất lượng DNA còn được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,2%.
Nhân dòng đoạn gen NAT2 bằng PCR
Gen NAT2 sẽ được xác định các SNP (NAT2*5, NAT2*6, NAT2*7) bằng phương pháp PCR- giải trình tự gen. Đầu tiên, DNA tổng số được sử dụng để nhân dịng đoạn gen NAT2 có độ dài 1093 bp sử dụng cặp mồi 5'-GGA ACA AAT TGG ACT TGG-3' và 5'-TCT AGC ATG AAT CAC TCT GC-3’ [56]. Các thành phần phản ứng được trình bày ở bảng 2.6.
Bảng 2.6: Thành phần tối ƣu cho phản ứng nhân dòng gen NAT2
Thành phần Nồng độ Thể tích 1 phản ứng (25 µL)
Nước khử ion 10
Master Mix Kapa2G Robust Hotstart DNA polymerase
1X 12.5
Mồi xi 10 µM 0,3 µM 0,75
Mồi ngược 10 µM 0,3 µM 0,75
DNA 1
Tối ưu phản ứng PCR: Để có quy trình nhân dịng đặc hiệu và ổn định, các
thí nghiệm tối ưu nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi và nồng độ DNA đã được tiến hành biến tính với 95 oC trong 3 phút, sau đó thực hiện 35 chu kỳ (95 o
C trong 15s, 58 oC trong 15s, 72oC trong 1 phút), giai đoạn kết thúc ở 72oC trong 10 giây và bảo quản ở 4oC. Sản phẩm PCR được đánh giá chất lượng trên gel agarose 1,5%, sử dụng thang chuẩn O Gene Ruler Ladder DNA marker/Massruler Express Forward DNA Ladder Mix để xác định kích thước sản phẩm.
Xác định kiểu gen NAT2 bằng phƣơng pháp giải trình tự
20 µL sản phẩm PCR đã được kiểm tra trên gel agarose sẽ được gửi đến hãng First base (Malaysia ) để giải trình tự bằng cách sử dụng cùng 1 mồi (5'-GGA ACA AAT TGG ACT TGG-3' và 5'-TCT AGC ATG AAT CAC TCT GC-3’) cho cả đoạn gen NAT2. Kết quả giải trình tự được đọc bằng phần mềm BioEdit version
7.1.9 để xác định kiểu gen của mỗi bệnh nhân. Các đọc như sau: mỗi nucleotit được thể hiện bằng một đỉnh với màu đặc trưng (A: màu xanh lá cây, C: màu xanh da trời, G: màu đen, T: màu đỏ). Tại vị trí cho mỗi nucleotit, nếu chỉ hiện 1 đỉnh màu thì bệnh nhân có kiểu gen đồng hợp tử, nếu xuất hiện hai đỉnh màu thì là kiểu gen dị hợp tử.
2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu
Dữ liệu nghiên cứu được phân tích thống kê sử dụng phần mềm SPSS 16.0. Thống kê mơ tả được trình bày, các thuật tốn phân tích t-student và ANOVA được sử dụng để phân tích các biến định lượng, kiểm định chi-square được sử dụng cho phân tích bảng tương liên và so sánh tỷ lệ.
2.3.7. Đạo đức nghiên cứu y học
Nghiên cứu đảm bảo các quy định về đạo đức trong thiết kế thử nghiệm lâm sàng của Bộ Y tế. Bệnh nhân trước khi tham gia nghiên cứu được thông báo đầy đủ về mục đích và mục tiêu nghiên cứu, cũng như lợi ích của nghiên cứu và những ảnh hưởng bất lợi của nghiên cứu tới bệnh nhân. Những bệnh nhân tham gia nghiên cứu sẽ được kí bản đồng thuận tham gia nghiên cứu. Bệnh nhân có quyền rút khỏi nghiên cứu bất cứ lúc nào. Các thơng tin của bệnh nhân được đảm bảo bí mật tuyệt đối và chỉ được sử dụng cho mục đích nghiên cứu.
Nghiên cứu đã được thơng qua tại Hội đồng đạo đức Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội trước khi triển khai thực hiện. Mẫu bệnh án và phiếu xác nhận tự nguyện tham gia nghiên cứu của bệnh nhân được thu thập đầy đủ.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Tính kháng thuốc của vi khuẩn lao đối với thuốc kháng lao hàng một
3.1.1. Đặc điểm chung của quần thể bệnh nhân nghiên cứu
Bảng 3.1: Thông tin chung của quần thể nghiên cứu
Chỉ số Thể lao Xác suất ( ̅ SD) hoặc % Lao mới (n=69) Lao tái trị (n=56) p Nam/Nữ 63,8/36,2 87,5/12,5 0,002 Tuổi (năm) 41,11 14,70 48,79 13,58 0,003 BMI 18,91 18,65 0,539
Từ tháng 3/2017 đến tháng 6/2018 chúng tôi ghi nhận trong số bệnh nhân đến khám và điều trị tại 03 bệnh viện (Bệnh Phổi Hà Nội, K74 Trung ương; Phổi Trung ương) có 125 bệnh nhân được chuẩn đoán lao phổi và được thực hiện test GenXpert MTB+/RIF- để loại trừ nhanh lao đa kháng. Có 69 bệnh nhân lao phổi mới (chiếm 55,2%) và 56 bệnh nhân lao phổi tái trị (44,8%) trong đó chủ yếu là lao tái phát (53 bệnh nhân). Giữa hai nhóm lao phổi mới là lao phổi tái trị có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ giới tính nam/nữ (p< 0.05).
Về mặt giới tính, mặc dù phụ nữ trong q trình sống có nhiều thời điểm dễ mắc lao hơn như thời kỳ có thai, ni con nhỏ, mãn kinh… nhưng các nghiên cứu trong và ngoài nước đều đưa ra nhận định nam giới có số lượng người mắc lao cao hơn nữ giới nhưng tỷ lệ nam/nữ lại khác nhau tùy theo nghiên cứu. Nam giới được cho là có nguy cơ tiếp xúc nguồn lây nhiều hơn nữ giới, cường độ làm việc cao hơn, có nhiều mối quan hệ xã hội rộng rãi, đồng thời có nhiều thói quen có hại như nghiện rượu, hút thuốc. Theo báo cáo của WHO (2018) năm 2017 trên tồn thế giới có khoảng 6 triệu nam giới mắc bệnh lao, trong khi đó chỉ chỉ xấp xỉ 3,2 triệu nữ giới mắc lao. Nghiên cứu tổng hợp của WHO mới đây cũng cho thấy số lượng nam giới mắc lao cao hơn so với nữ giới ở hầu hết các nghiên cứu ở các nước có thu
nhập thấp và trung bình [26]. Ở Việt Nam, năm 2006-2007, chương trình chống lao quốc gia đã thực hiện điều tra tình hình mắc lao tồn quốc cho thấy tỷ lệ mắc lao của nam giới cao hơn nữ giới là 4-5 lần [3]. Ở nghiên cứu của chúng tôi tỷ lệ nam/nữ là 2,9, cao hơn không đáng kể trong một số nghiên cứu trong nước khác ở mức 2,4 lần [12], [20]. Điều này có thể giải thích do nghiên cứu chỉ giới hạn trong bệnh nhân lao phổi, số lượng nghiên cứu chưa đủ lớn và do những năm gần đây sự phát triển điều kiện kinh tế - xã hội - nhận thức của người dân làm tăng cơ hội tiếp cận hệ thống y tế của phụ nữ.
Tỷ lệ chênh lệch nam/nữ ở nhóm lao phổi mới là 1,76 xấp xỉ tỷ lệ 1,92 trong nghiên cứu của Hoàng Thị Phượng (2009) [13]. Tỷ lệ nam/nữ ở nhóm lao phổi tái trị của nghiên cứu là 7,0 cao hơn so với trong nghiên cứu của Hoàng Hà (4,0) (2009) [4]. Sự khác biệt về tỷ lệ nam/nữ giữa hai nhóm lao phổi tái trị và lao phổi mới trong nghiên cứu mang ý nghĩa thống kê (p< 0,05). Tỷ lệ nam giới trong nhóm lao phổi tái trị cao hơn so với nữ giới rất nhiều. Nguyên nhân có thể là do nam giới thường không có kiên nhẫn để tuân thủ quá trình điều trị, cùng những yếu tố nguy cơ cao như hút thuốc, nghiện rượu vì vậy thường dẫn đến sự tái phát. Tại Việt Nam chúng tơi chưa tìm được cơng bố nào trong các nghiên cứu báo cáo về mối quan hệ giữa giới tính trong nhóm lao phổi mới và lao tái trị. Nhận định này có thể là lưu ý quan trọng với bác sỹ điều trị, đặc biệt lưu ý các đối tượng bệnh nhân nam trong quá trình điều trị để đảm bảo đạt được kết quả điều trị cao nhất ngay từ lần đầu.
Độ tuổi trung bình trong nghiên cứu của nhóm lao phổi tái trị (48,79) cao hơn nhóm lao phổi mới (41,11). Sự khác biệt về độ tuổi trung bình giữa hai nhóm có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Điều này phản ánh mối quan hệ giữa độ tuổi và tình trạng mắc lao mới thấp hơn lao tái trị. Sự khác biệt giữa hai nhóm có thể là do ở người lớn tuổi tình trạng đề kháng chung của cơ thể kém hơn so với người trẻ tuổi. Vì vậy những quần thể vi khuẩn nằm ngủ trong cơ thể sẽ có cơ hội tái hoạt động, mặt khác cũng dễ làm cho người lớn tuổi dễ ngoại nhiễm vi khuẩn lao hơn người trẻ.
Chỉ số khối cơ thể (BMI) trung bình của nhóm lao phổi mới là 18,91 và của nhóm lao phổi tái trị là 18,65. BMI trung bình của hai nhóm là tương đương nhau. Đây là mức BMI ở gần ngưỡng bình thường theo chỉ số dinh dưỡng (18,5). Chỉ số này cũng tương tự như trong nghiên cứu của Hoàng Thị Phượng (2009) là 18,71[13].
Hình 3.1: Biểu đồ dinh dƣỡng theo BMI của hai nhóm bệnh nhân
Phân loại tình trạng dinh dưỡng theo chỉ số BMI của người Việt Nam (theo WPRO), ở người Việt Nam trưởng thành từ 25-64 tuổi, có tỷ lệ tình trạng thiếu cân 20,9%; tình trạng bình thường 62,9%; tình trạng thừa cân 9,7% và béo phì 6,6% [2]. Chỉ số BMI của bệnh nhân nghiên cứu nằm trong 3 nhóm: gầy (thiếu cân), bình thường và thừa cân. Khơng có bệnh nhân tình trạng béo phì ở cả hai nhóm lao. Điều này phù hợp với nghiên cứu của Tverdal khi nghiên cứu 1.717.655 người trên 14 tuổi trong 8-19 năm, tỷ lệ mắc lao phổi giảm khi tăng BMI, tỷ lệ giống nhau cho cả hai giới và mọi lứa tuổi [23]. Một nghiên cứu khác trên diện rộng kéo dài 20 năm tại Hoa Kỳ, loại bỏ các trường hợp đã mắc lao trước khi nghiên cứu cũng đưa ra nhận định tỷ lệ mắc lao ở những người có chỉ số BMI thấp (<18,5) cao hơn ở những người có chỉ số BMI bình thường, cao và rất cao [41]. Tuy nhiên nghiên cứu gần đây tại Hàn Quốc trong vòng 5 năm từ 2007 đến 2013, các bệnh nhân mắc lao trước đó được loại trừ cũng cho thấy chỉ số BMI tăng có thể làm giảm nguy cơ mắc lao
nhưng chỉ số BMI rất cao (>30) lại không làm giảm nguy cơ mắc lao ở phụ nữ trẻ [39]. Còn trong đa phần các nghiên cứu tại Việt Nam, những thống kê về mối liên quan giữa chỉ số BMI và người mắc lao đều cho thấy những người mắc lao phần lớn có chỉ số BMI thấp [13]. Điều này có thể được giải thích do các nghiên cứu tại Việt Nam phần lớn là nghiên cứu tại thời điểm bệnh nhân đã bị lao, khi đó bệnh nhân đã có tình trạng suy kiệt cơ thể ảnh hưởng đến cân nặng. Ngồi ra cũng có thể do điều kiện dinh dưỡng ảnh hưởng đến chỉ số BMI liên quan đến điều kiện lao động của những người nhiễm lao. Vì vậy để có thể đưa ra những nhận định đúng về mối liên quan giữa chỉ số BMI và tình trạng mắc lao tại Việt Nam cần có các nghiên cứu nhiều năm đo được BMI trước khi nhiễm lao.
3.1.2. Tình hình kháng thuốc chống lao hàng 1 ở các bệnh nhân lao phổi 3.1.2.1. Kết quả nuôi cấy vi khuẩn lao 3.1.2.1. Kết quả nuôi cấy vi khuẩn lao
Bảng 3.2: Thời gian nuôi cấy và đơn vị sinh trƣởng của vi khuẩn lao
Chỉ số Thể lao Xác suất
( ̅ SE) Lao mới
(n=69)
Lao tái trị (n=56)
p
Thời gian nuôi cấy (giờ)
210,35 10,37 250,61 13,65 0,018
Đơn vị sinh trƣởng (GU)
2285,0 658,57 1915,3 748,70 0,711
Thời gian ni cấy trung bình (giờ) ở nhóm lao phổi mới (210) thấp hơn nhóm lao phổi tái trị (250) (p< 0,05). Đơn vị sinh trưởng GU giữa hai nhóm khơng có sự khác biệt. Có sự dao động lớn giữa các cá thể về đơn vị sinh trưởng và thời gian ni cấy ở trên cả hai nhóm.
Thời gian ni cấy được tính từ lúc mẫu được đưa vào máy ni cấy đến lúc máy báo dương khi nồng độ trong ống nuôi cấy đạt 105 - 106 CFU/mL. Nồng độ vi khuẩn trong ống phụ thuộc vào nồng độ vi khuẩn ban đầu của mẫu, vì vậy thời gian ni cấy của các mẫu sẽ khác nhau. Một số nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh,
thời gian nuôi cấy tỷ lệ nghịch với số lượng khuẩn lạc được tính trên số CFU/mL [27], [24]. Chỉ số thời gian nuôi cấy trong môi trường MGIT sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc đánh giá định lượng Mycobacterium tuberculosis, đặc biệt là trong việc đánh giá sớm hiệu quả trong điều trị.
3.1.2.2. Kết quả kháng sinh đồ vi khuẩn lao
Sau 42 ngày, kết quả kháng sinh đồ đặc với 4 loại thuốc RMP, INH, SM, EMB sẽ được kết luận dựa trên kết quả vi khuẩn mọc trên ống môi trường thử nghiệm. Hình 3.2 là kết quả kháng sinh đồ đặc với bốn loại thuốc kháng lao INH, RMP, SM, EMB của một số chủng trong nghiên cứu.
Kháng INH, RIF, EMB; Nhạy SM Kháng SM; Nhạy INH, RIF, EMB
Kháng INH, RIF, SM; EMB Nhạy INH, RIF, SM, EMB
Đối với kháng sinh đồ lỏng PZA trong vòng 21 ngày máy sẽ tự động báo kết quả. Các kết quả kháng sinh đồ đặc và lỏng được ghi nhận và phân tích với từng loại thuốc. Hình 3.3 thể hiện tỷ lệ số thuốc kháng mỗi loại của 5 loại thuốc kháng