2.1. NGUYÊN LIỆU 2.1.1. Mẫu dƣợc liệu 2.1.1. Mẫu dƣợc liệu
Các mẫu thực vật, bao gồm: lá cây Thạch châu (Pyrenaria jonqueriana Pierre.), lá Ổi (Psidium guajava L.), cây Ma hoàng (Ephedra distachya L.) đƣợc thu hái và kiểm tra tính chính xác về lồi thơng qua đặc điểm hình thái bởi TS. Đỗ Thị Xuyến, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Mẫu nghiên cứu hiện đƣợc lƣu giữ tại Khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu.
2.1.2. Các hoá chất, nguyên liệu khác
Các hóa chất chính sử dụng cho nghiên cứu bao gồm: protease HIV-1 là sản phẩm của đề tài mã số: ĐT-PTNTĐ.2012-G/02; pepsin, hemoglobin, pepstatin A, dimethyl sulphoxide (DMSO), Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBB), cơ chất peptide L6525(Lys-Ala-Arg-Val-Nle-p-nitro-Phe-Glu-Ala-amide) đặc hiệu cho protease HIV-1 của Sigma-Aldrich (Mỹ), kit xác định hoạt tính protease HIV-1 sử dụng cơ chất huỳnh quang Kit SensoLyte® 520 HIV-1 Protease Assay (Anaspec, Mỹ).
Các hóa chất khác nhƣ trichloroacetic acid (TCA), agar, urea, β- mercaptoethanol… đều đạt độ tinh sạch dành cho phân tích.
2.2. MÁY MĨC VÀ TRANG THIẾT BỊ
Các máy móc, trang thiết bị chính sử dụng cho nghiên cứu bao gồm: tủ ấm 37ºC (Memmert, Anh); tủ an toàn sinh học cấp 2 (Nuaire, Mỹ); máy li tâm lạnh 5417R (Eppendorf, Đức); máy li tâm Sigma 3K (Sartorius, Đức); máy gia nhiệt khô Multi Blok® Heater (Lab-Line Instruments, Hoa Kỳ); máy quang phổ (Thermo Scientific, Hoa Kỳ); máy quang phổ kiến DU 800 (Beckman coulter, Hoa Kỳ); máy NanoDrop huỳnh quang 3300 (Thermo Scientific, Hoa Kỳ).
Các dụng cụ, trang thiết bị cơ bản khác của phòng Protein tái tổ hợp thuộc Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzyme và Protein.
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phân tách các hợp chất từ dịch chiết thực vật
- Lá dƣợc liệu (1,5 kg) độ ẩm 8,5% đƣợc cắt nhỏ, chiết hồi lƣu với ethanol 96% ở nhiệt độ sôi (chiết 3 lần, mỗi lần 4 giờ).
- Dịch chiết đƣợc gộp lại và cất loại dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc cao chiết ethanol đã cô khô.
- Cao chiết đƣợc hịa tan vào nƣớc cất (0,5 lít) thành nhũ dịch và tiếp tục chiết phân đoạn lần lƣợt với các dung mơi có độ phân cực tăng dần theo thứ tự n- hexan (Hx) (0,5 lít × 3 lần), ethyl acetate (EtOAc) (0,5 lít × 3 lần), n-butanol (BuOH) (0,5 lít × 3 lần).
- Các dịch chiết Hx, EtOAc và BuOH đƣợc tách riêng, cất loại dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc các phần cao tƣơng ứng.
- Cao phân đoạn có hoạt tính ức chế tốt tiếp tục đƣợc chạy qua cột sắc ký silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi dicloromethan/methanol với tỷ lệ methanol tăng dần từ 0 đến 100%.
- Thành phần dịch rửa giải đƣợc kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng. Sự có mặt của các hợp chất quan tâm đƣợc quan sát bản sắc ký dƣới đèn tử ngoại ở bƣớc sóng UV - 254 nm, 365 nm và ánh sáng trắng sau khi phun thuốc thử H2SO4 10%/ethanol và sấy ở 110oC trong 5 phút.
- Phân đoạn lựa chọn đƣợc chạy qua cột silica gel rửa giải với hệ dung môi gradient n-hexan/ethyl acetat (4/1; 2/1; 1/1) thu đƣợc hợp chất quan tâm.
2.3.2. Xác định cấu trúc của chất đƣợc phân tách
Công thức cấu tạo của chất phân tách đƣợc xác định thơng qua các tính chất lý hóa (cảm quan, nhiệt độ nóng chảy) và các phổ tử ngoại (UV), hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1
H-NMR, 13C-NMR, DEPT, sử dụng chất nội chuẩn là TMS - tetramethyl silan) và so sánh với các dữ liệu đã cơng bố.
2.3.3. Xác định hoạt tính ức chế pepsin bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch có chứa cơ chất hemoglobin thạch có chứa cơ chất hemoglobin
Trong giai đoạn sàng lọc ban đầu, hoạt tính ức chế protease HIV-1 của các dịch chiết thực vật đƣợc đánh giá gián tiếp thông qua khả năng ức chế pepsin phân giải cơ chất hemoglobin [2]. Quá trình chuẩn bị đĩa thạch gồm các bƣớc nhƣ sau:
1. Các đĩa agar (2,5%) đƣợc chuẩn bị trong đệm acetate 50 mM pH 3,5, chứa hemoglobin (0,3%) và đƣợc đục các lỗ (đƣờng kính 4 mm) để cho mẫu phân tích. 2. 10 µl dịch chiết thực vật hoặc các phân đoạn tinh sạch pha trong DMSO đƣợc cho vào giếng, ủ 37ºC trong 15 phút cho đến khi dịch chiết khuếch tán một phần vào đĩa thạch.
3. 10 µl pepsin (1 mg/ml) pha trong HCl 0,01 N đƣợc bổ sung và tiếp tục ủ ở 37ºC trong 2 giờ. Mẫu kiểm tra âm là mẫu thay đồng thời dịch chiết bằng DMSO, thay pepsin bằng dung dịch pha pepsin (HCl 0,01 N), mẫu kiểm tra dƣơng là mẫu chỉ thay dịch chiết (chứa chất ức chế) bằng DMSO.
4. Sau khi ủ 120 phút, đĩa thạch đƣợc nhuộm bằng dung dịch CBB 0,25% và đƣợc tẩy nhiều lần cho tới khi nhìn rõ vịng phân giải của pepsin.
Hoạt tính ức chế pepsin đƣợc đánh giá trên cơ sở đo vòng phân giải cơ chất, so sánh giữa mẫu thí nghiệm và các mẫu kiểm tra. Đƣờng kính vịng phân giải càng bé thì hoạt tính ức chế của dịch chiết càng tốt. Cụ thể, khả năng ức chế của các hợp chất thực vật đƣợc thống kê trên cơ sở (Bảng 2.1.).
Bảng 2.1. Mức độ ức chế pepsin của các hợp chất thực vật theo đƣờng kính vịng phân giải Đƣờng kính vịng phân giải (ĐKVPG) (cm) Mức độ ức chế 0 < ĐKVPG ≤ 0,6 cm +++ 0,6 < ĐKVPG ≤ 0,9 ++ 0,9 < ĐKVPG < 1,1 + 1,1 ≤ ĐKVPG - (Không ức chế)
2.3.4. Xác định hoạt tính ức chế pepsin theo phƣơng pháp Anson cải tiến
Bên cạnh phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch, hoạt tính ức chế pepsin của các dịch chiết thực vật cũng đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp Anson cải tiến với cơ chất hemoglobin theo quy trình mơ tả của hãng Sigma Aldrich [94].
Nguyên tắc: Hemoglobin bị phân cắt bởi pepsin thành các peptide và acid amin hòa tan. Phần cơ chất dƣ thừa đƣợc loại bỏ bằng kết tủa và ly tâm. Sự có mặt của các acid amin thơm trong sản phẩm thủy phân đƣợc xác định thông qua độ hấp thụ của chúng ở bƣớc sóng 280 nm (A280) và là cơ sở để đánh giá hoạt độ của pepsin. Khi có mặt của chất ức chế, hoạt độ phân giải hemoglobin giảm đi so với mẫu khơng có chất ức chế.
Cách tiến hành: Pepsin đƣợc ủ với dịch chiết thực vật ở 37ºC, 5 phút. Sau đó bổ sung hemoglobin 2% trong HCl 60 mM và tiếp tục ủ ở 37ºC trong 15 phút. Phản ứng đƣợc làm ngừng bằng cách bổ sung TCA 5%, sản phẩm phân giải trong dịch nổi thu đƣợc sau khi ly tâm đƣợc xác định bằng cách đo độ hấp thụ ánh sáng ở 280 nm (A280). Mẫu kiểm tra là pepsin bị bất hoạt bằng TCA 5%
trƣớc khi bổ sung cơ chất. Hoạt độ pepsin đƣợc đánh giá trên cơ sở hiệu số số đọc A280 của mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm tra.
Cơng thức tính % ức chế:
Trong đó: AĐC và ATN lần lƣợt là độ hấp thụ tại bƣớc sóng 280 nm của mẫu đối chứng và mẫu thí nghiệm.
2.3.5. Xác định hoạt tính protease HIV-1 sử dụng cơ chất peptide đặc hiệu
Hoạt tính ức chế protease HIV-1 của các hợp chất đƣợc xác định bằng cách sử dụng cơ chất tổng hợp có liên kết đặc hiệu dựa theo phƣơng pháp đƣợc mô tả bởi Richards và tập thể [64].
Nguyên tắc: Cơ chất peptide với trình tự Lys-Ala-Arg-Val-Leu*Nph-Glu-Ala-
Met (Sigma-Aldrich) chứa vị trí phân cắt của protease HIV-1 dƣới dạng cải biến Nle
% ức chế =
AĐC - ATN AĐC
(nonleucine) và 4-NO2- phenylalanine (Nph) có khả năng hấp thụ ánh sáng cực đại ở bƣớc sóng 300 nm (A300). Dƣới tác dụng thủy phân của protease HIV-1 liên kết bị phân giải, đo độ giảm A300 theo thời gian trên máy quang phổ kế UV-VIS.
Cách tiến hành:
Enzyme và chất ức chế đƣợc ủ trƣớc với nhau trong mơi trƣờng đệm thử hoạt tính (Bảng 2.2.) trong 5 phút.
20 µL cơ chất đƣợc bổ sung.
Hỗn hợp đƣợc trộn đều và tiến hành đo mức độ giảm A300 trên hệ thống máy quang phổ trong 10 phút ở 37oC.
Mẫu kiểm tra hay đối chứng là mẫu thay dung dịch chứa chất ức chế bằng đệm chiết hay dung mơi hịa tan chất ức chế.
Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng đo hoạt độ protease HIV-1 sử dụng cơ chất peptide đặc hiệu L6525
Thành phần Thể tích (μL)
H2O khử ion, khử trùng 127
Đệm 2x (Na-acetate 200 mM, pH 4.5, EDTA 8 mM,
-mecaptoethanol 10 mM, NaCl 1.8 M, CaCl2 10 mM) 150
Cơ chất 1mg/ml 20
Chất ức chế (ở các nồng độ khác nhau) 1
Protease HIV-1 150 ng/l 2
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ PROTEASE HIV-1 CỦA THẠCH CHÂU (PYRENARIA JONQUERIANA PIERRE.), ỔI (PSIDIUM GUAJAVA L.) VÀ MA HOÀNG (EPHEDRA DISTACHYA L.)
Nguyễn Văn Dũng và tập thể đã tiến hành sàng lọc hoạt tính ức chế pepsin/protease HIV-1 của các cao chiết cồn từ 136 lồi thực vật; kết quả cho thấy có 5 cao chiết gồm: hạt Bơ (Persea americana Mill.), lá Gối hạc (Leea rubra L.), cây Ma hoàng (Ephedra sinica L.), lá Ổi (Psidium guajava L.) và lá Thạch châu (Pyrenaria jonqueriana Pierre.) ức chế mạnh enzyme này. Từ dịch chiết ethanol lá cây Gối hạc (Leea rubra L.), hợp chất acid maslinic (2α,3β-dihydroxy-olean-12- en-28-oic acid; công thức phân tử C30H48O4) đƣợc phân lập. Hợp chất này có tác
dụng ức chế mạnh pepsin và protease HIV-1 với giá trị IC50 tƣơng ứng là 3,2 mM và 4,5 µM [2]. Trên cơ sở đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn Thạch châu Pyrenaria jonqueriana Pierre. (Theaceae), lá cây Ổi Psidium guajava L. (Myrtaceae) và cây Ma hoàng Ephedra distachya L. (Ephedraceae) để tiếp tục
phân lập, tinh sạch chất ức chế tiềm năng protease HIV-1 và nghiên cứu tính chất của các hoạt chất thu đƣợc.
3.1.1. Khả năng ức chế pepsin của của các dịch chiết và phân đoạn từ lá cây Thạch châu (Pyrenaria jonqueriana Pierre.)
Cây Thạch châu Pyrenaria jonqueriana Pierre. thuộc họ Chè (Theaceae) là
một loài cây mới đƣợc phát hiện ở một số tỉnh nƣớc ta (Lâm Đồng, Quảng Trị, Lào Cai). Ngƣời dân những vùng này từ lâu đã thu hái và sử dụng Thạch châu để pha nƣớc uống giải nhiệt thay cho chè. Ngoài ra, Thạch Châu còn đƣợc sử dụng trong các bài thuốc để thanh nhiệt, lợi tiểu, tăng sức đề kháng... Theo các nghiên cứu, nhiều thực vật trong họ Chè (Theaceae) thƣờng chứa nhiều hợp chất thứ cấp quan trọng nhƣ tanin, flavonoid, polyphenol, triterpen và glycoside… [86]. Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam và trên thế giới có rất ít tài liệu nghiên cứu về cây Thạch châu,
các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào đặc điểm hình thái và phân loại. Do đó, nghiên cứu của chúng tơi s góp phần cung cấp thêm các thơng tin về thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của các hợp chất phân lập từ cây Thạch châu.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành chiết cao ethanol tổng số của lá cây Thạch châu trong các dung môi hexane (Hx), ethyl acetate (EtOAc) và butanol (BuOH) có độ phân cực tăng dần để thu riêng các phân đoạn và cao nƣớc. Các dịch chiết này sau đó đƣợc kiểm tra khả năng ức chế pepsin bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch với cơ chất hemoglobin.
Kết quả Hình 3.1. cho thấy, tại các giếng đối chứng chỉ có dung dịch pha pepsin HCl là 0,01 N (Giếng 1), và dung môi pha chất nghiên cứu là DMSO 100% (Giếng 2) đều khơng có vịng phân giải; với giếng chỉ có pepsin (Giếng 3) hoặc pepsin và DMSO (Giếng 4), đƣờng kính vịng phân giải cơ chất là lớn nhất 1,2 cm. Qua đó chứng tỏ, vịng phần giải do hoạt tính của pepsin tạo ra. Trong khi đó, một số giếng chứa dịch chiết cũng nhƣ pepstatin A (Giếng 5) có đƣờng kính vịng phân giải bị giảm đi. Dựa vào đƣờng kính vịng phân giải (Hình 3.1. và Bảng 3.1.) có thể kết luận, phân đoạn BuOH ức chế hoạt tính pepsin tốt nhất (Giếng 9).
Hình 3.1. Khả năng ức chế pepsin của các dịch chiết từ lá cây Thạch châu dịch chiết từ lá cây Thạch châu
Giếng 1: dung dịch pha pepsin (HCl 0,01 N), giếng 2: DMSO, giếng 3: pepsin (khơng có chất ức chế), giếng 4: pepsin + DMSO, giếng 5: pepsin + Pepstatin A, giếng 6: cao ethanol, giếng 7 - 10: phân đoạn cao Hx, EtOAc, BuOH và cao nƣớc.
Bảng 3.1. Khả năng ức chế pepsin của các dịch chiết lá cây Thạch châu STT Tên mẫu Đƣờng kính vịng (cm) Khả năng ức chế 1 HCl 0,01N 0,4 - 2 DMSO 100% 0,4 - 3 Pepsin 1 mg/ml 1,2 - 4 DMSO 100% + pepsin 1,2 - 5 Pepstatin A 5 µM 0,4 +++ 6 Cao ethanol 100 mg/ml 1,05 + 7 Cao Hx 100 mg/ml 1,15 - 8 Cao EtOAc 100 mg/ml 1,05 + 9 Cao BuOH 100 mg/ml 1,0 + 10 Cao nƣớc 100 mg/ml 1,15 -
3.1.2. Khả năng ức chế pepsin của của các dịch chiết và phân đoạn từ lá cây Ổi (Psidium guajava L.)
Cây Ổi (guava) có tên khoa học là Psidium guajava L., thuộc họ Sim (Myrtaceae) có nguồn gốc từ châu Mỹ, sau đó đƣợc trồng phổ biến khắp các miền nhiệt đới châu Á và châu Phi [74]. Ở Việt Nam, cây Ổi đƣợc trồng để lấy quả ăn và đƣợc biết đến nhƣ một loại dƣợc liệu truyền thống trong y học cổ truyền. Các phần khác nhau của cây Ổi đƣợc dùng làm thuốc điều trị một loạt các bệnh ở ngƣời: điều trị đi ngoài, bệnh tả, bỏng, liền da, hạ sốt, ho, viêm họng, viêm phế quản ở trẻ em… [4]. Trong cây Ổi có nhiều hợp chất hữu cơ thứ cấp, gồm saponin, alkaloid, tannin, flavonoid, steroid, tinh dầu và rất giàu các chất thuộc nhóm triterpen [75]. Triterpen đã đƣợc biết đến với nhiều tác dụng sinh học và có nhiều tiềm năng trong điều trị bệnh nhƣ chống lại quá trình tăng sinh của tế bào ung thƣ, điều trị tiểu đƣờng, chống oxi hoá, kháng viêm, ngăn chặn các bệnh tim mạch, bảo vệ hệ thần kinh và kháng HIV-1... [11, 35, 52, 84].
Tƣơng tự lá cây Thạch châu, dịch chiết ethanol lá cây Ổi cũng đƣợc chiết bởi các dung mơi Hx, EtOAc và BuOH có độ phân cực tăng dần để thu đƣợc các cao tƣơng ứng. Khi tiến hành kiểm tra khả năng ức chế pepsin bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch (Hình 3.2. và Bảng 3.2.) và dựa trên đƣờng kính của vịng phân giải cho thấy các phân đoạn Hx và EtOAc có hoạt tính ức chế pepsin tốt nhất (Hình 3.2., giếng 7 và 8).
Hình 3.2. Khả năng ức chế pepsin của các dịch chiết từ lá cây Ổi các dịch chiết từ lá cây Ổi
Giếng 1: dung dịch pha pepsin (HCl 0,01N), giếng 2: DMSO, giếng 3: pepsin (khơng có chất ức chế), giếng 4: pepsin + DMSO, giếng 5: pepsin + Pepstatin A, giếng 6: cao ethanol, giếng 7 - 10: phân đoạn cao Hx, EtOAc, BuOH và cao nƣớc.
Bảng 3.2. Khả năng ức chế pepsin của các dịch chiết từ lá cây Ổi
STT Tên mẫu Đƣờng kính vịng (cm) Khả năng ức chế 1 HCl 0,01N 0,4 - 2 DMSO 100% 0,4 - 3 Pepsin 1 mg/ml 1,1 - 4 DMSO 100% + pepsin 1,1 - 5 Pepstatin A 5 µM 0,5 +++ 6 Cao ethanol 100 mg/ml 0,95 + 7 Cao Hx 100 mg/ml 0,9 ++ 8 Cao EtOAc 100 mg/ml 0,9 ++ 9 Cao BuOH 100 mg/ml 1,0 + 10 Cao nƣớc 100 mg/ml 1,1 -
3.1.3. Khả năng ức chế pepsin của của các dịch chiết và phân đoạn từ thân cây Ma hoàng (Ephedra distachya L.) Ma hoàng (Ephedra distachya L.)
Ma hoàng Ephedra distachya L. là loài cây bụi thuộc họ Ma hoàng
(Ephedraceae). Trong y học cổ truyền, Ma hoàng thƣờng đƣợc dùng để chữa các chứng bệnh cảm mạo phong hàn, tức ngực, hen suyễn, phù thũng, làm ra mồ hôi, trừ lạnh, trừ ho hen, long đờm, lợi tiểu… Các nghiên cứu về thành phần hóa học cho thấy, chi Ma hồng có chứa alkaloid với tỷ lệ 1 - 2,5%, trong đó chủ yếu là ephedrine có tác dụng gây hƣng phấn tinh thần và giảm đau. Ngồi ra, ma hồng cịn chứa nhiều hợp chất thứ cấp nhƣ flavonoid, tannin, tinh dầu, acid hữu cơ, các hợp chất phenol… [41].
Các cao đƣợc phân tách từ dịch chiết ethanol của cây Ma hoàng trong các dung mơi có độ phân cực khác nhau cũng đã đƣợc nghiên cứu ảnh hƣởng lên hoạt tính của pepsin theo phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch chứa hemoglobin. Kết quả thu đƣợc (Hình 3.3. và Bảng 3.3.) cho thấy cao BuOH có khả năng ức chế pepsin tốt nhất (Hình 3.3., giếng 9).
Hình 3.3. Khả năng ức chế pepsin của các dịch chiết từ thân Ma hoàng dịch chiết từ thân Ma hoàng
Giếng 1: dung dịch pha pepsin (HCl 0,01N), giếng 2: DMSO, giếng 3: pepsin (khơng có chất ức chế), giếng 4: pepsin + DMSO, giếng 5: pepsin + Pepstatin A, giếng 6: cao ethanol, giếng 7 - 10: phân đoạn cao Hx, EtOAc, BuOH và cao nƣớc.
Bảng 3.3. Khả năng ức chế pepsin của các dịch chiết từ Ma hoàng STT Tên mẫu Đƣờng kính vịng (cm) Khả năng ức chế 1 HCl 0,01N 0,4 - 2 DMSO 100% 0,4 - 3 Pepsin 1 mg/ml 1,2 - 4 DMSO 100% + pepsin 1,2 - 5 Pepstatin A 5 µM 0,4 +++