STT Tên mẫu Đƣờng kính vịng (cm) Khả năng ức chế 1 HCl 0,01N 0,4 - 2 DMSO 100% 0,4 - 3 Pepsin 1 mg/ml 1,1 - 4 DMSO 100% + pepsin 1,1 - 5 Pepstatin A 5 µM 0,5 +++ 6 Cao ethanol 100 mg/ml 0,95 + 7 Cao Hx 100 mg/ml 0,9 ++ 8 Cao EtOAc 100 mg/ml 0,9 ++ 9 Cao BuOH 100 mg/ml 1,0 + 10 Cao nƣớc 100 mg/ml 1,1 -
3.1.3. Khả năng ức chế pepsin của của các dịch chiết và phân đoạn từ thân cây Ma hoàng (Ephedra distachya L.) Ma hoàng (Ephedra distachya L.)
Ma hoàng Ephedra distachya L. là loài cây bụi thuộc họ Ma hoàng
(Ephedraceae). Trong y học cổ truyền, Ma hoàng thƣờng đƣợc dùng để chữa các chứng bệnh cảm mạo phong hàn, tức ngực, hen suyễn, phù thũng, làm ra mồ hôi, trừ lạnh, trừ ho hen, long đờm, lợi tiểu… Các nghiên cứu về thành phần hóa học cho thấy, chi Ma hồng có chứa alkaloid với tỷ lệ 1 - 2,5%, trong đó chủ yếu là ephedrine có tác dụng gây hƣng phấn tinh thần và giảm đau. Ngồi ra, ma hồng cịn chứa nhiều hợp chất thứ cấp nhƣ flavonoid, tannin, tinh dầu, acid hữu cơ, các hợp chất phenol… [41].
Các cao đƣợc phân tách từ dịch chiết ethanol của cây Ma hoàng trong các dung mơi có độ phân cực khác nhau cũng đã đƣợc nghiên cứu ảnh hƣởng lên hoạt tính của pepsin theo phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch chứa hemoglobin. Kết quả thu đƣợc (Hình 3.3. và Bảng 3.3.) cho thấy cao BuOH có khả năng ức chế pepsin tốt nhất (Hình 3.3., giếng 9).
Hình 3.3. Khả năng ức chế pepsin của các dịch chiết từ thân Ma hoàng dịch chiết từ thân Ma hoàng
Giếng 1: dung dịch pha pepsin (HCl 0,01N), giếng 2: DMSO, giếng 3: pepsin (khơng có chất ức chế), giếng 4: pepsin + DMSO, giếng 5: pepsin + Pepstatin A, giếng 6: cao ethanol, giếng 7 - 10: phân đoạn cao Hx, EtOAc, BuOH và cao nƣớc.
Bảng 3.3. Khả năng ức chế pepsin của các dịch chiết từ Ma hoàng STT Tên mẫu Đƣờng kính vịng (cm) Khả năng ức chế 1 HCl 0,01N 0,4 - 2 DMSO 100% 0,4 - 3 Pepsin 1 mg/ml 1,2 - 4 DMSO 100% + pepsin 1,2 - 5 Pepstatin A 5 µM 0,4 +++ 6 Cao ethanol 100 mg/ml 1,05 + 7 Cao Hx 100 mg/ml 1,1 - 8 Cao EtOAc 100 mg/ml 1,1 - 9 Cao BuOH 100 mg/ml 1,05 + 10 Cao nƣớc 100 mg/ml 1,2 -
Theo kết quả thử khuếch tán trên đĩa thạch, đƣờng kính vịng phân giải của giếng có bổ sung cao ethanol tổng số lá cây Ổi với nồng độ 100 mg/mL là 0,95 cm, trong khi đó, hai giếng bổ sung cao ethanol từ lá Thạch châu và cây Ma hoàng ở cùng nồng độ đều có đƣờng kính là 1,15 cm. Bên cạnh đó, hoạt tính của các cao Hx, cao EtOAc, cao BuOH và cao nƣớc từ dịch chiết ethnol lá Ổi cũng đều ức chế pepsin tốt hơn các cao tƣơng ứng thu đƣợc từ dịch ethanol lá Thạch châu và thân Ma hoàng, đặc biệt là hai cao EtOAc và Hx từ lá Ổi. Nhƣ vậy, bƣớc đầu chúng tơi có thể kết luận hoạt tính ức chế pepsin của các dịch chiết từ lá Ổi tốt hơn dịch chiết từ lá Thạch châu và cây Ma hoàng. Từ kết quả này, lá cây Ổi đƣợc lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm phân lập, tinh sạch hợp chất có hoạt tính ức chế protease HIV-1.
3.2. TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ PROTEASE HIV-1 CỦA HỢP CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT LÁ CÂY ỔI (PSIDIUM GUAJAVA L.)
Khi tiến hành khảo sát cao phân đoạn Hx và EtOAc của lá cây Ổi trên sắc ký bản mỏng (Hình 3.4.) chúng tơi nhận thấy vết chính trong hai phân đoạn này là cùng một hợp chất (màu vàng, Rf = 0,7). Dựa vào đặc điểm của hợp chất này trên bản mỏng và tham khảo các tài liệu về thành phần hoá học của cây Ổi, nhóm hợp
chất chính này đƣợc dự đốn là triterpen [15, 21]. Khảo sát nhiều hệ dung môi khác nhau cũng cho thấy các vết của cao phân đoạn Hx từ lá Ổi (Hình 3.4., giếng 1) phân tách rõ ràng hơn các vết của cao chiết EtOAc (Hình 3.4., giếng 2) và đặc biệt là vết chính (triterpen) không bị chồng lặp với các vết khác. Trên cơ sở một số công bố về khả năng ức chế của triterpen với HIV-1 [35], cao phân đoạn Hx đƣợc lựa chọn cho các nghiên cứu phân lập chất ức chế protease HIV-1 tiếp theo.
Hình 3.4. Sắc ký đồ SKLM định tính các cao phân đoạn của dịch chiết lá cây Ổi cao phân đoạn của dịch chiết lá cây Ổi
(cao Hx (giếng 1); cao EtAOc (giếng 2))
3.2.1. Kết quả tách phân đoạn và đánh giá hoạt tính ức chế pepsin/protease HIV-1 từ cao Hx của lá Ổi HIV-1 từ cao Hx của lá Ổi
Cao phân đoạn Hx từ dịch chiết ethanol tổng số của lá cây Ổi đƣợc chạy qua cột sắc ký silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi dicloromethan/methanol với tỷ lệ methanol tăng dần từ 0 đến 100%. Dịch rửa giải đƣợc chia thành 5 phân đoạn chính ký hiệu lần lƣợt là: PĐ1; PĐ2; PĐ3; PĐ4 và PĐ5. Kết quả kiểm tra khả năng ức chế pepsin của các phân đoạn Hình 3.5. và Bảng 3.4. cho thấy, PĐ2 có khả năng ức chế pepsin mạnh nhất (Hình 3.5., giếng 8).
Hình 3.5. Khả năng ức chế pepsin của các phân đoạn tinh sạch từ cao Hx của lá Ổi phân đoạn tinh sạch từ cao Hx của lá Ổi
Giếng 1: dung dịch pha pepsin (HCl 0,01 N), giếng 2: DMSO, giếng 3: pepsin (không có chất ức chế), giếng 4: pepsin + DMSO, giếng 5: pepsin + Pepstatin, giếng 6: cao ethanol, giếng 7: phân đoạn cao Hx, giếng 8-12: phân đoạn PĐ 1 - 5.
Bảng 3.4. Khả năng ức chế pepsin của các phân đoạn từ cao Hx lá cây Ổi
STT Tên mẫu Đƣờng kính vịng (cm) Khả năng ức chế 1 HCl 0,01N 0,4 - 2 DMSO 100% 0,4 - 3 Pepsin 1 mg/ml 1,1 - 4 DMSO 100% + pepsin 1,15 - 5 Pepstatin A 5 µM 0,5 +++ 6 Cao ethanol 50 mg/ml 1,05 + 7 Cao Hx 50 mg/ml 1,05 + 8 PĐ1 50 mg/ml 1,0 + 9 PĐ2 50 mg/ml 0,9 ++ 10 PĐ3 50 mg/ml 1,0 + 11 PĐ4 50 mg/ml 1,15 - 12 PĐ5 50 mg/ml 1,15 -
Để khẳng định chắc chắn dịch chiết và các phân đoạn lá cây Ổi ức chế pepsin có thể ức chế protease HIV-1, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của PĐ2 lên hoạt tính phân giải cơ chất peptide đặc hiệu của protease HIV-1. Kết quả thu đƣợc ở Hình 3.6. cho thấy, tại nồng độ 4,5 µg/mL, PĐ2 ức chế trên 70% hoạt tính của protease HIV-1.
0.332 0.342 0.352 0.362 0.372 0.382 0.392 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Độ hấp thụ tại A300 Thời gian (phút)
Hình 3.6. Hoạt tính ức chế protease HIV-1 của PĐ2
( ) Khơng có chất ức chế, ( ) phân đoạn PĐ2 4,5 µg/mL
Để khảo sát thành phần các hợp chất có mặt trong PĐ2 chúng tơi tiến hành phân tích phân đoạn này bằng sắc ký lớp mỏng (silica gel pha thƣờng, hệ dung mơi n-hexan/ethyl acetate; 1/2). Kết quả thu đƣợc (Hình 3.7.) cho thấy, PĐ2 có một vết chính (màu vàng, Rf = 0,7, quan sát UV-365 nm sau khi phun thuốc thử H2SO4 10% ethanol, sấy bản mỏng ở 110o
C trong 5 phút). Đây là hợp chất triterpen chính có trong cả cao phân đoạn Hx và EtOAc. Chính vì vậy, chúng tơi định hƣớng phân lập hợp chất này.
Hình 3.7. Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng phân đoạn PĐ2
3.2.2. Kết quả tinh sạch và đánh giá hoạt tính ức chế pepsin/protease HIV-1 của hợp chất LO-I của hợp chất LO-I
PĐ2 tiếp tục đƣợc đƣa lên cột silica gel rửa giải gradient với hệ dung môi n- hexan/ethyl acetate (4/1; 2/1; 1/1) thu đƣợc hợp chất, ký hiệu là LO-I. Kết quả thử khả năng ức chế cho thấy: LO-I có hoạt tính ức chế pepsin rõ rệt (Hình 3.8. và Bảng 3.5.). Khi tăng dần nồng độ LO-I từ 5 đến 50 mg/ml, đƣờng kính vịng phân giải giảm dần hay hoạt tính ức chế pepsin của LO-I tăng dần. LO-I tại nồng độ 50 mg/ml ức chế pepsin gần tƣơng đƣơng với pepstatin A 5 µM.
Hình 3.8. Khả năng ức chế pepsin các phân đoạn tinh sạch từ dịch chiết lá cây Ổi phân đoạn tinh sạch từ dịch chiết lá cây Ổi
Giếng 1:dung dịch pha pepsin (HCl 0,01 N), giếng 2: DMSO, giếng 3: pepsin (khơng có chất ức chế), giếng 4: pepsin + DMSO, giếng 5: pepsin + Pepstatin A, giếng 6: cao ethanol, giếng 7: phân đoạn cao Hx, giếng 8: PĐ2 và giếng 9-12: LO-I với các nồng độ từ 5 - 10 - 25 - 50 mg/ml.
Bảng 3.5. Khả năng ức chế pepsin của hợp chất LO-I từ lá cây Ổi STT Tên mẫu Đƣờng kính vịng STT Tên mẫu Đƣờng kính vịng (cm) Khả năng ức chế 1 HCl 0,01N 0 - 2 DMSO 100% 0 - 3 Pepsin 1 mg/ml 1,1 - 4 DMSO 100% + pepsin 1,1 - 5 Pepstatin A 5 µM 0,5 +++ 6 Cao ethanol 50 mg/ml 0,95 + 7 Cao Hx 50 mg/ml 1,0 + 8 PĐ2 50 mg/ml 0,8 ++ 9 LO-I 5 mg/ml 0,9 ++ 10 LO-I 10 mg/ml 0,8 ++ 11 LO-I 25 mg/ml 0,75 ++ 12 LO-I 50 mg/ml 0,6 ++
Kiểm tra hoạt tính ức chế protease HIV-1 với cơ chất đặc hiệu chúng tôi thấy LO-I ức chế hơn 70% hoạt tính protease HIV-1 tại nồng độ 2,5 µg/ml (Hình 3.9.). Khi so sánh với khả năng ức chế protease HIV-1 giữa LO-I và PĐ2 chúng tôi thấy, hợp chất LO-I ức chế protease HIV-1 mạnh hơn PĐ2 1,8 lần. Nhƣ vậy, có thể khẳng định LO-I chính là hoạt chất có khả năng ức chế protease HIV-1 đang quan tâm.
0.245 0.255 0.265 0.275 0.285 0.295 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Đ ộ h ấp th ụ tại A300 Thời gian (phút)
Hình 3.9. Hoạt tính phân cắt cơ chất của protease HIV-1 khi có và khơng có LO-I
( ) Khơng có chất ức chế, ( ) LO-I 2,5 µg/mL
3.2.3. Xác định cấu trúc hợp chất LO-I
Kết quả phân tích hợp chất LO-I cho thấy: Hợp chất LO-I thu đƣợc ở dạng bột vơ định hình màu trắng, nhiệt độ nóng chảy: 260-262 oC. Phổ UV (Phụ lục 1) (MeOH) λmax: 202 nm. Phổ IR (cm-1 ) (Phụ lục 2): 3424; 2926; 1690. Phổ ESI-MS (Phụ lục 3) (m/z) =455 [M-H]. Phổ 1H-NMR (Phụ lục 4) (CD3OD+CDCl3; 500 MHz): 5,14(1H, t, 4,0, H-12), 3,07 (1H, dd, 4,5; 11,0, H-3), 2,11 (1H, d, 11,5, H- 18), 1,01; 0,87; 0,86; 0,75; 0,68 (tín hiệu 3H, s, H-27; 23; 25; 26; 24), 0,89 (3H, d, 6,5, H-29), 0,79 (3H, d, 6,5, H-30). Phổ 13C-NMR (Phụ lục 5) (CD3OD+CDCl3; 125 MHz): 39,5 (C-1), 27,6 (C-2), 79,4 (C-3), 39,7 (C-4), 56,3 (C-5), 19,2 (C-6), 28,6 (C-7), 40,4 (C-8), 48,5 (C-9), 37,7 (C-10), 24,1 (C-11), 126,5 (C-12), 139,2 (C-13), 42,9 (C-14), 34,0 (C-15), 25,1 (C-16), 48,5 (C-17), 53,9 (C-18), 39,9 (C-19), 40,1 (C-20), 31,5 (C-21), 37,8 (C-22), 28,9 (C-23), 17,5 (C-24), 16,2 (C-25), 15,9 (C- 26), 24,1 (C-27), 181,4 (C-28), 17,6 (C-29), 21,5 (C-30).
Phổ IR cho biết trong phân tử LO-I có các nhóm chức OH (dải hấp thụ có đỉnh 3424 cm-1) và nhóm C=O (đỉnh 1690 cm-1). Phổ 1
H-NMR cho biết có một proton olefin có δH 5,14 ppm; có 5 tín hiệu proton của của nhóm methyl xuất hiện ở dạng
một đỉnh đơn ở độ chuyển dịch từ 0,68 ppm đến 1,01ppm, hai tín hiệu nhóm CH3 xuất hiện dƣới dạng đỉnh kép với hằng số ghép cặp J=6,5 Hz. Các phổ 13C-NMR và DEPT (Phụ luc 6) cho biết có tổng cộng 30 tín hiệu cacbon trong cấu trúc của hợp chất LO-I, bao gồm 7 nhóm methyl (CH3), 9 nhóm methylen (CH2), 7 nhóm methin (CH), 7 cacbon bậc 4 (C). Trong đó có các tín hiệu cacbon carbonyl (C=O; δc 181,4 ppm) và hai cacbon olefin (δc 126,5 và 139,2 ppm). Dựa trên tất cả các dữ kiện phổ, chất số LO-I đƣợc dự đoán là một triterpen khung ursan. Phổ ESI-MS có đỉnh ion tại
m/z 455 [M-H]- (negative) cho biết công thức phân tử của LO-I là C30H48O3 (M=456,7). Từ việc phân tích các dữ liệu phổ, kết hợp với tài liệu tham khảo [4, 8] hợp chất LO-I đƣợc xác định là acid ursolic (3β-hydroxy-urs-12-ene-28-oic-acid) với cơng thức cấu tạo đƣợc trình bày ở Hình 3.10.
Hình 3.10. Cơng thức cấu tạo hợp chất acid ursolic (LO-I)
3.3. NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA ACID URSOLIC 3.3.1. Hoạt tính ức chế đặc hiệu protease HIV-1của acid ursolic 3.3.1. Hoạt tính ức chế đặc hiệu protease HIV-1của acid ursolic
Nghiên cứu ảnh hƣởng của acid ursolic lên hoạt độ của protease HIV-1 cho thấy acid ursolic ức chế mạnh protease HIV-1 với nồng độ cơ chất tại đó 50% protease còn hoạt động (IC50) là 3,5 µM (Hình 3.11.A). Tại nồng độ 20 µM của acid ursolic, hoạt tính của protease HIV-1 gần nhƣ bị ức chế hồn tồn. Bên cạnh đó, khi sử dụng phƣơng pháp Anson cải tiến trong ống nghiệm, chúng tôi thấy acid ursolic ức chế hoạt động của pepsin với IC50 là 2,5 mM (Hình 3.11.B). Nhƣ vậy, acid ursolic đã ức chế protease HIV-1 mạnh hơn 700 lần so với ức chế pepsin, chứng tỏ chất ức chế này đặc hiệu cao hơn với protease
HIV-1. Tuy nhiên, do cơ chất dùng cho protease HIV-1 không thể dùng cho pepsin và ngƣợc lại nên sự khác nhau về cơ chất có thể làm gia tăng sự khác biệt về mức độ ức chế hai enzyme này bởi acid ursolic.
0 20 40 60 80 100 0 5 10 15 20 H oạt đ ộ cịn l ại ( %) Acid ursolic (µM) 0 20 40 60 80 100 0 1 2 3 4 5 H o ạt đ ộ c ị n lạ i (% ) Acid ursolic (mM)
Hình 3.11. Hoạt tính ức chế của acid ursolic với protease HIV-1 (A) và pepsin (B)
3.3.2. Cơ chế ức chế protease HIV-1 của acid ursolic
Nghiên cứu kiểu ức chế của acid ursolic đối với protease HIV-1 đƣợc xác định trên cơ sở sự thay đổi các giá trị Km và Vmax của protease HIV-1 trong điều kiện khơng có chất ức chế là acid ursolic (chỉ có dung mơi DMSO hoà tan acid ursolic) so với khi có mặt của acid ursolic tại nồng độ 1,5 và 20 µM. Trong đó, Km
và Vmax đƣợc xác định khi thuỷ phân cơ chất đặc hiệu của protease HIV-1 với nồng độ tăng dần và dựa theo phƣơng trình Lineweaver - Burk. Phƣơng trình Lineweaver - Burk là nghịch đảo của phƣơng trình Michaelis - Menten, có ý nghĩa đối với việc nghiên cứu chất ức chế enzyme. Phƣơng trình biểu diễn dƣới dạng đƣờng thẳng y=ax+b, cắt trục tung tại giá trị 1/Vmax và trục hồnh tại -1/Km:
(Trong đó, Vo: Vận tốc ban đầu của phản ứng; Vmax: Vận tốc cực đại; [S]: Nồng độ cơ chất; Km: Hằng số Michaelis)
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 -0.03 -0.02 -0.01 0.01 0.02 0.03 0.04 1/ V (µ m ol /p h ú t) 1/S (µM-1)
Hình 3.12. Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng phân giải cơ chất của protease HIV-1 vào nồng độ cơ chất trong điều kiện có và khơng có chất ức chế theo
phƣơng trình Lineweaver Burk
( ): Khơng có chất ức chế, ( ): Acid ursolic 1,5 µM, ( ): Acid ursolic 20 µM Từ đồ thị Hình 3.12., chúng tơi tính đƣợc giá trị Km và Vmax của protease HIV-1 ở các điều kiện khác nhau thể hiện trong Bảng 3.6..
Bảng 3.6. Sự thay đổi Km và Vmax của protease HIV-1 khi có và khơng có acid ursolic và khơng có acid ursolic
DMSO 100% Acid ursolic
1,5 µM
Acid ursolic 20 µM
Km (µM) 217,71 127,80 49,76
Vmax (nmol/phút) 18,9 10,7 9
Kết quả Hình 3.12. và Bảng 3.6. cho thấy, khi có mặt của acid ursolic, các giá trị Km và Vmax của protease HIV-1 đều giảm. Do đó, acid ursolic đã ức chế protease HIV-1 theo kiểu không cạnh tranh (uncompetitive).
Acid ursolic (còn đƣợc gọi là urson, prunol, malol) là một triterpenoid vịng năm cạnh có cơng thức phân tử C30H48O3 đƣợc phân lập đầu tiên từ cây Táo (Malus domestica Borkh.) vào năm 1920 [12]. Đến nay, acid ursolic đã đƣợc biết có mặt trong rất nhiều loài thực vật khác nhau; đƣợc xem là một chất bảo vệ hố học, khơng gây độc hại và đƣợc sử dụng trong các sản phẩm y tế, mỹ phẩm khác nhau [8, 11]. Acid ursolic cịn đƣợc biết có nhiều hoạt tính sinh học tốt nhƣ gây độc cho tế bào ung thƣ, chống oxi hoá hiệu quả; kháng viêm, kháng nấm, vi khuẩn, trực khuẩn lao, virus và ức chế một số enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp DNA [11, 57]. Khả năng ức chế protease HIV-1 của acid ursolic cùng với một số acid triterpen khác tinh sạch từ dịch chiết loài thực vật Geum japonicum, họ
Hoa hồng (Rosaceae) đã đƣợc phát hiện từ khá sớm [87].
Acid ursolic cũng đã đƣợc phân lập từ cây Ổi và có hoạt tính thúc đẩy tăng sinh, biệt hố và hấp thụ glucose của tế bào hay chống viêm, chống oxy hoá [48]. Trong nghiên cứu này, acid ursolic phân lập từ lá cây Ổi có hoạt tính ức chế protease HIV-1 với nồng độ IC50 là 3,5 µM tốt hơn acid ursolic đƣợc phân lập từ nấm Toả dƣơng (Cynomorium songaricum Rupr.) [53] và các thực vật khác [11]. Nghiên cứu này là lần đầu tiên cho thấy cơ chế tác dụng của acid ursolic với