phân đoạn tinh sạch từ cao Hx của lá Ổi
Giếng 1: dung dịch pha pepsin (HCl 0,01 N), giếng 2: DMSO, giếng 3: pepsin (khơng có chất ức chế), giếng 4: pepsin + DMSO, giếng 5: pepsin + Pepstatin, giếng 6: cao ethanol, giếng 7: phân đoạn cao Hx, giếng 8-12: phân đoạn PĐ 1 - 5.
Bảng 3.4. Khả năng ức chế pepsin của các phân đoạn từ cao Hx lá cây Ổi
STT Tên mẫu Đƣờng kính vịng (cm) Khả năng ức chế 1 HCl 0,01N 0,4 - 2 DMSO 100% 0,4 - 3 Pepsin 1 mg/ml 1,1 - 4 DMSO 100% + pepsin 1,15 - 5 Pepstatin A 5 µM 0,5 +++ 6 Cao ethanol 50 mg/ml 1,05 + 7 Cao Hx 50 mg/ml 1,05 + 8 PĐ1 50 mg/ml 1,0 + 9 PĐ2 50 mg/ml 0,9 ++ 10 PĐ3 50 mg/ml 1,0 + 11 PĐ4 50 mg/ml 1,15 - 12 PĐ5 50 mg/ml 1,15 -
Để khẳng định chắc chắn dịch chiết và các phân đoạn lá cây Ổi ức chế pepsin có thể ức chế protease HIV-1, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của PĐ2 lên hoạt tính phân giải cơ chất peptide đặc hiệu của protease HIV-1. Kết quả thu đƣợc ở Hình 3.6. cho thấy, tại nồng độ 4,5 µg/mL, PĐ2 ức chế trên 70% hoạt tính của protease HIV-1.
0.332 0.342 0.352 0.362 0.372 0.382 0.392 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Độ hấp thụ tại A300 Thời gian (phút)
Hình 3.6. Hoạt tính ức chế protease HIV-1 của PĐ2
( ) Khơng có chất ức chế, ( ) phân đoạn PĐ2 4,5 µg/mL
Để khảo sát thành phần các hợp chất có mặt trong PĐ2 chúng tơi tiến hành phân tích phân đoạn này bằng sắc ký lớp mỏng (silica gel pha thƣờng, hệ dung môi n-hexan/ethyl acetate; 1/2). Kết quả thu đƣợc (Hình 3.7.) cho thấy, PĐ2 có một vết chính (màu vàng, Rf = 0,7, quan sát UV-365 nm sau khi phun thuốc thử H2SO4 10% ethanol, sấy bản mỏng ở 110o
C trong 5 phút). Đây là hợp chất triterpen chính có trong cả cao phân đoạn Hx và EtOAc. Chính vì vậy, chúng tơi định hƣớng phân lập hợp chất này.
Hình 3.7. Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng phân đoạn PĐ2
3.2.2. Kết quả tinh sạch và đánh giá hoạt tính ức chế pepsin/protease HIV-1 của hợp chất LO-I của hợp chất LO-I
PĐ2 tiếp tục đƣợc đƣa lên cột silica gel rửa giải gradient với hệ dung môi n- hexan/ethyl acetate (4/1; 2/1; 1/1) thu đƣợc hợp chất, ký hiệu là LO-I. Kết quả thử khả năng ức chế cho thấy: LO-I có hoạt tính ức chế pepsin rõ rệt (Hình 3.8. và Bảng 3.5.). Khi tăng dần nồng độ LO-I từ 5 đến 50 mg/ml, đƣờng kính vịng phân giải giảm dần hay hoạt tính ức chế pepsin của LO-I tăng dần. LO-I tại nồng độ 50 mg/ml ức chế pepsin gần tƣơng đƣơng với pepstatin A 5 µM.
Hình 3.8. Khả năng ức chế pepsin các phân đoạn tinh sạch từ dịch chiết lá cây Ổi phân đoạn tinh sạch từ dịch chiết lá cây Ổi
Giếng 1:dung dịch pha pepsin (HCl 0,01 N), giếng 2: DMSO, giếng 3: pepsin (khơng có chất ức chế), giếng 4: pepsin + DMSO, giếng 5: pepsin + Pepstatin A, giếng 6: cao ethanol, giếng 7: phân đoạn cao Hx, giếng 8: PĐ2 và giếng 9-12: LO-I với các nồng độ từ 5 - 10 - 25 - 50 mg/ml.
Bảng 3.5. Khả năng ức chế pepsin của hợp chất LO-I từ lá cây Ổi STT Tên mẫu Đƣờng kính vịng STT Tên mẫu Đƣờng kính vịng (cm) Khả năng ức chế 1 HCl 0,01N 0 - 2 DMSO 100% 0 - 3 Pepsin 1 mg/ml 1,1 - 4 DMSO 100% + pepsin 1,1 - 5 Pepstatin A 5 µM 0,5 +++ 6 Cao ethanol 50 mg/ml 0,95 + 7 Cao Hx 50 mg/ml 1,0 + 8 PĐ2 50 mg/ml 0,8 ++ 9 LO-I 5 mg/ml 0,9 ++ 10 LO-I 10 mg/ml 0,8 ++ 11 LO-I 25 mg/ml 0,75 ++ 12 LO-I 50 mg/ml 0,6 ++
Kiểm tra hoạt tính ức chế protease HIV-1 với cơ chất đặc hiệu chúng tôi thấy LO-I ức chế hơn 70% hoạt tính protease HIV-1 tại nồng độ 2,5 µg/ml (Hình 3.9.). Khi so sánh với khả năng ức chế protease HIV-1 giữa LO-I và PĐ2 chúng tôi thấy, hợp chất LO-I ức chế protease HIV-1 mạnh hơn PĐ2 1,8 lần. Nhƣ vậy, có thể khẳng định LO-I chính là hoạt chất có khả năng ức chế protease HIV-1 đang quan tâm.
0.245 0.255 0.265 0.275 0.285 0.295 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Đ ộ h ấp th ụ tại A300 Thời gian (phút)
Hình 3.9. Hoạt tính phân cắt cơ chất của protease HIV-1 khi có và khơng có LO-I
( ) Khơng có chất ức chế, ( ) LO-I 2,5 µg/mL
3.2.3. Xác định cấu trúc hợp chất LO-I
Kết quả phân tích hợp chất LO-I cho thấy: Hợp chất LO-I thu đƣợc ở dạng bột vơ định hình màu trắng, nhiệt độ nóng chảy: 260-262 oC. Phổ UV (Phụ lục 1) (MeOH) λmax: 202 nm. Phổ IR (cm-1 ) (Phụ lục 2): 3424; 2926; 1690. Phổ ESI-MS (Phụ lục 3) (m/z) =455 [M-H]. Phổ 1H-NMR (Phụ lục 4) (CD3OD+CDCl3; 500 MHz): 5,14(1H, t, 4,0, H-12), 3,07 (1H, dd, 4,5; 11,0, H-3), 2,11 (1H, d, 11,5, H- 18), 1,01; 0,87; 0,86; 0,75; 0,68 (tín hiệu 3H, s, H-27; 23; 25; 26; 24), 0,89 (3H, d, 6,5, H-29), 0,79 (3H, d, 6,5, H-30). Phổ 13C-NMR (Phụ lục 5) (CD3OD+CDCl3; 125 MHz): 39,5 (C-1), 27,6 (C-2), 79,4 (C-3), 39,7 (C-4), 56,3 (C-5), 19,2 (C-6), 28,6 (C-7), 40,4 (C-8), 48,5 (C-9), 37,7 (C-10), 24,1 (C-11), 126,5 (C-12), 139,2 (C-13), 42,9 (C-14), 34,0 (C-15), 25,1 (C-16), 48,5 (C-17), 53,9 (C-18), 39,9 (C-19), 40,1 (C-20), 31,5 (C-21), 37,8 (C-22), 28,9 (C-23), 17,5 (C-24), 16,2 (C-25), 15,9 (C- 26), 24,1 (C-27), 181,4 (C-28), 17,6 (C-29), 21,5 (C-30).
Phổ IR cho biết trong phân tử LO-I có các nhóm chức OH (dải hấp thụ có đỉnh 3424 cm-1) và nhóm C=O (đỉnh 1690 cm-1). Phổ 1
H-NMR cho biết có một proton olefin có δH 5,14 ppm; có 5 tín hiệu proton của của nhóm methyl xuất hiện ở dạng
một đỉnh đơn ở độ chuyển dịch từ 0,68 ppm đến 1,01ppm, hai tín hiệu nhóm CH3 xuất hiện dƣới dạng đỉnh kép với hằng số ghép cặp J=6,5 Hz. Các phổ 13C-NMR và DEPT (Phụ luc 6) cho biết có tổng cộng 30 tín hiệu cacbon trong cấu trúc của hợp chất LO-I, bao gồm 7 nhóm methyl (CH3), 9 nhóm methylen (CH2), 7 nhóm methin (CH), 7 cacbon bậc 4 (C). Trong đó có các tín hiệu cacbon carbonyl (C=O; δc 181,4 ppm) và hai cacbon olefin (δc 126,5 và 139,2 ppm). Dựa trên tất cả các dữ kiện phổ, chất số LO-I đƣợc dự đốn là một triterpen khung ursan. Phổ ESI-MS có đỉnh ion tại
m/z 455 [M-H]- (negative) cho biết công thức phân tử của LO-I là C30H48O3 (M=456,7). Từ việc phân tích các dữ liệu phổ, kết hợp với tài liệu tham khảo [4, 8] hợp chất LO-I đƣợc xác định là acid ursolic (3β-hydroxy-urs-12-ene-28-oic-acid) với công thức cấu tạo đƣợc trình bày ở Hình 3.10.
Hình 3.10. Cơng thức cấu tạo hợp chất acid ursolic (LO-I)
3.3. NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA ACID URSOLIC 3.3.1. Hoạt tính ức chế đặc hiệu protease HIV-1của acid ursolic 3.3.1. Hoạt tính ức chế đặc hiệu protease HIV-1của acid ursolic
Nghiên cứu ảnh hƣởng của acid ursolic lên hoạt độ của protease HIV-1 cho thấy acid ursolic ức chế mạnh protease HIV-1 với nồng độ cơ chất tại đó 50% protease cịn hoạt động (IC50) là 3,5 µM (Hình 3.11.A). Tại nồng độ 20 µM của acid ursolic, hoạt tính của protease HIV-1 gần nhƣ bị ức chế hồn tồn. Bên cạnh đó, khi sử dụng phƣơng pháp Anson cải tiến trong ống nghiệm, chúng tôi thấy acid ursolic ức chế hoạt động của pepsin với IC50 là 2,5 mM (Hình 3.11.B). Nhƣ vậy, acid ursolic đã ức chế protease HIV-1 mạnh hơn 700 lần so với ức chế pepsin, chứng tỏ chất ức chế này đặc hiệu cao hơn với protease
HIV-1. Tuy nhiên, do cơ chất dùng cho protease HIV-1 không thể dùng cho pepsin và ngƣợc lại nên sự khác nhau về cơ chất có thể làm gia tăng sự khác biệt về mức độ ức chế hai enzyme này bởi acid ursolic.
0 20 40 60 80 100 0 5 10 15 20 H oạt đ ộ còn l ại ( %) Acid ursolic (µM) 0 20 40 60 80 100 0 1 2 3 4 5 H o ạt đ ộ c ị n lạ i (% ) Acid ursolic (mM)
Hình 3.11. Hoạt tính ức chế của acid ursolic với protease HIV-1 (A) và pepsin (B)
3.3.2. Cơ chế ức chế protease HIV-1 của acid ursolic
Nghiên cứu kiểu ức chế của acid ursolic đối với protease HIV-1 đƣợc xác định trên cơ sở sự thay đổi các giá trị Km và Vmax của protease HIV-1 trong điều kiện khơng có chất ức chế là acid ursolic (chỉ có dung mơi DMSO hồ tan acid ursolic) so với khi có mặt của acid ursolic tại nồng độ 1,5 và 20 µM. Trong đó, Km
và Vmax đƣợc xác định khi thuỷ phân cơ chất đặc hiệu của protease HIV-1 với nồng độ tăng dần và dựa theo phƣơng trình Lineweaver - Burk. Phƣơng trình Lineweaver - Burk là nghịch đảo của phƣơng trình Michaelis - Menten, có ý nghĩa đối với việc nghiên cứu chất ức chế enzyme. Phƣơng trình biểu diễn dƣới dạng đƣờng thẳng y=ax+b, cắt trục tung tại giá trị 1/Vmax và trục hoành tại -1/Km:
(Trong đó, Vo: Vận tốc ban đầu của phản ứng; Vmax: Vận tốc cực đại; [S]: Nồng độ cơ chất; Km: Hằng số Michaelis)
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 -0.03 -0.02 -0.01 0.01 0.02 0.03 0.04 1/ V (µ m ol /p h ú t) 1/S (µM-1)
Hình 3.12. Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng phân giải cơ chất của protease HIV-1 vào nồng độ cơ chất trong điều kiện có và khơng có chất ức chế theo
phƣơng trình Lineweaver Burk
( ): Khơng có chất ức chế, ( ): Acid ursolic 1,5 µM, ( ): Acid ursolic 20 µM Từ đồ thị Hình 3.12., chúng tơi tính đƣợc giá trị Km và Vmax của protease HIV-1 ở các điều kiện khác nhau thể hiện trong Bảng 3.6..
Bảng 3.6. Sự thay đổi Km và Vmax của protease HIV-1 khi có và khơng có acid ursolic và khơng có acid ursolic
DMSO 100% Acid ursolic
1,5 µM
Acid ursolic 20 µM
Km (µM) 217,71 127,80 49,76
Vmax (nmol/phút) 18,9 10,7 9
Kết quả Hình 3.12. và Bảng 3.6. cho thấy, khi có mặt của acid ursolic, các giá trị Km và Vmax của protease HIV-1 đều giảm. Do đó, acid ursolic đã ức chế protease HIV-1 theo kiểu không cạnh tranh (uncompetitive).
Acid ursolic (còn đƣợc gọi là urson, prunol, malol) là một triterpenoid vịng năm cạnh có cơng thức phân tử C30H48O3 đƣợc phân lập đầu tiên từ cây Táo (Malus domestica Borkh.) vào năm 1920 [12]. Đến nay, acid ursolic đã đƣợc biết có mặt trong rất nhiều lồi thực vật khác nhau; đƣợc xem là một chất bảo vệ hố học, khơng gây độc hại và đƣợc sử dụng trong các sản phẩm y tế, mỹ phẩm khác nhau [8, 11]. Acid ursolic cịn đƣợc biết có nhiều hoạt tính sinh học tốt nhƣ gây độc cho tế bào ung thƣ, chống oxi hoá hiệu quả; kháng viêm, kháng nấm, vi khuẩn, trực khuẩn lao, virus và ức chế một số enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp DNA [11, 57]. Khả năng ức chế protease HIV-1 của acid ursolic cùng với một số acid triterpen khác tinh sạch từ dịch chiết loài thực vật Geum japonicum, họ
Hoa hồng (Rosaceae) đã đƣợc phát hiện từ khá sớm [87].
Acid ursolic cũng đã đƣợc phân lập từ cây Ổi và có hoạt tính thúc đẩy tăng sinh, biệt hoá và hấp thụ glucose của tế bào hay chống viêm, chống oxy hoá [48]. Trong nghiên cứu này, acid ursolic phân lập từ lá cây Ổi có hoạt tính ức chế protease HIV-1 với nồng độ IC50 là 3,5 µM tốt hơn acid ursolic đƣợc phân lập từ nấm Toả dƣơng (Cynomorium songaricum Rupr.) [53] và các thực vật khác [11]. Nghiên cứu này là lần đầu tiên cho thấy cơ chế tác dụng của acid ursolic với proteases HIV-1. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Loan và Phan Tuấn Nghĩa [56] cũng đã phát hiện đƣợc một số hợp chất ức chế protease HIV-1 nhƣ: 8- hydroxyquinoline, menadione và acid asiatic với nồng độ IC50 tƣơng ứng là 104 µM, 114,3 µM và 18,9 µM khi thử ở cùng điều kiện. Nhƣ vậy, các chất này có tác dụng ức chế protease HIV-1 yếu hơn đáng kể so với acid ursolic, hợp chất có hàm lƣợng lớn trong lá cây Ổi. Các kết quả trong nghiên cứu này gợi ý về khả năng phát triển và sử dụng lá cây Ổi và hoạt chất acid ursolic trong điều trị HIV.
3.3.3. Dạng chế phẩm phù hợp của acid ursolic
Chế phẩm là sản phẩm bào chế nói chung của một hoặc nhiều dƣợc chất. Chế phẩm của một loại dƣợc chất có thể có nhiều dạng khác nhau (dạng bột, dạng dịch lỏng, dạng hỗn dịch, dạng keo,…) tùy thuộc vào mục tiêu sử dụng (đƣa thuốc vào
cơ thể, bảo quản, dùng cho nghiên cứu in vitro, in vivo,…). Sau khi có hoạt chất,
phần lớn các nghiên cứu thƣờng tìm ra dạng chế phẩm có hiệu quả sử dụng cao nhất: tăng khả năng hòa tan trong nƣớc (dẫn tới tăng khả năng hấp thu vào cơ thể), tăng cƣờng sinh khả dụng.... Bên cạnh đó, với mục tiêu chính là bảo quản, hầu hết các chế phẩm thƣờng đƣợc sử dụng ở dạng bột với ƣu điểm là bền, hạn chế các phản ứng gây sự biến đổi chất, thuận lợi cho quá trình hấp thu, đặc biệt là phƣơng pháp sản xuất đơn giản dẫn tới giá thành rẻ hơn các dạng bào chế khác. Để xác định dạng chế phẩm bảo quản phù hợp cho acid ursolic là dạng bột hay dung dịch, trƣớc tiên, chúng tơi tiến hành hồ tan acid ursolic trong 5 dung môi khác nhau. Nồng độ thử nghiệm là 2 mg chất/300 µl dung mơi hịa tan (tƣơng ứng với khoảng 6,6 mg/ml), nồng độ này đƣợc lựa chọn dựa trên thực nghiệm, sao cho thu đƣợc dung dịch mẫu thử có nồng độ phù hợp với các phép thử trƣớc đây. Kết quả cho thấy acid ursolic tan tốt (thu đƣợc dung dịch trong suốt) trong các dung môi DMSO và ethanol; không tan tốt (xuất hiện vẩn đục dù sau khi đã siêu âm) trong ethyl acetate và trong nƣớc. Đối với trƣờng hợp sử dụng dung mơi hịa tan là acetone, acid uroslic khơng tan hồn tồn. Tuy nhiên, sau khi siêu âm trong 5 phút thì thu đƣợc dung dịch trong suốt. Từ những kết quả trên, chúng tôi lựa chọn các mẫu chế phẩm hòa tan trong DMSO, ethanol, acetone và mẫu chế phẩm dạng bột (khi thử nghiệm hòa tan trong DMSO) để đánh giá tác dụng ức chế enzym protease HIV-1.
Tiếp theo, chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng ức chế protease HIV-1 của acid ursolic ở các dạng chế phẩm khác nhau. Dạng 1: dạng bột, hịa tan trong dung mơi DMSO trƣớc khi thử phản ứng; Dạng 2: dạng dung dịch, hịa tan trong dung mơi DMSO; Dạng 3: dạng dung dịch, hịa tan trong dung mơi acetone; Dạng 4: dạng dung dịch, hịa tan trong dung mơi ethanol. Hình 3.13. thể hiện hoạt tính ức chế protease HIV-1 của các dạng chế phẩm acid ursolic khác nhau. Cụ thể acid ursolic ở dạng 1, 2, 3 và 4 đã ức chế protease HIV-1 với giá trị IC50 tƣơng ứng là: 2,0 µg/mL (Hình 3.13.A), 2,3 µg/mL (Hình 3.13.B), 4,2 µg/mL (Hình 3.13.C) và 3,9 µg/mL (Hình 3.13.D).
Hình 3.13. Hoạt tính ức chế protease HIV-1 của các dạng chế phẩm acid ursolic
A) Dạng 1; B) Dạng 2); C) Dạng 3; D) Dạng 4
Nhƣ vậy, ở dạng dung dịch, acid ursolic hoà tan trong DMSO (Dạng 2) có hoạt tính ức chế protease HIV-1 cao nhất gấp tƣơng ứng 1,7 lần và gần 2 lần so với khi hoà tan trong acetone (Dạng 3) và ethanol (Dạng 4). So sánh giữa dạng bột, hồ trong DMSO trƣớc khi tiến hành thí nghiệm (Dạng 1) và dạng dung dịch acid ursolic đƣợc bảo quản trong dung dịch DMSO (Dạng 2) thì giá trị IC50 của dạng 1 thấp hơn dạng 2. Sự chênh lệch chƣa đáng kể, tuy nhiên chế phẩm bảo quản dạng bột thƣờng ổn định và không cần yêu cầu nhiệt độ khắt khe khi bảo quản lâu dài nhƣ dạng dung dịch nên việc tạo chế phẩm acid ursolic để bảo quản ở dạng bột s đƣợc lựa chọn.
KẾT LUẬN
Từ các kết quả thu đƣợc trong q trình nghiên cứu, chúng tơi rút ra một số kết luận nhƣ sau:
1. Đã xác định đƣợc khả năng, mức độ ức chế của các dịch chiết và phân đoạn lá cây Thạch châu, lá cây Ổi và cây Ma hoàng lên hoạt tính phân giải cơ chất của pepsin. Các phân đoạn lá cây Ổi có khả năng ức chế pepsin mạnh nhất đƣợc lựa chọn cho các nghiên cứu cứu phân lập và tinh sạch hợp chất có hoạt tính ức chế pepsin/protease HIV-1.
2. Đã phân lập, tinh sạch và xác định đƣợc acid ursolic (3β-hydroxy-urs-12- ene-28-oic-acid) từ dịch chiết ethanol của lá cây Ổi có hoạt tính ức chế pepsin/protease HIV-1 mạnh nhất.
3. Acid ursolic có hoạt tính ức chế đặc hiệu protease HIV-1 với giá trị IC50 là 3,5 µM theo cơ chế không cạnh tranh. Dạng chế phẩm phù hợp của acid ursolic là dạng bột, trƣớc khi sử dụng tiến hành hoà tan hoạt chất trong DMSO.
KIẾN NGHỊ
Từ q trình nghiên cứu thực tế chúng tơi đƣa ra một số kiến nghị sau:
1. Tối ƣu hố quy trình phân đoạn và tinh sạch acid ursolic từ lá cây Ổi.