thu đƣợc từ C. songaricum [38] R1 R2 IC50 (µM) Protease HIV H COOH 8 COCH3 COOH 13 COCOOH COOH 7
CHOCH2CHOOH COOH 6
CO(CH2)2COOH COOH 6
CO(CH2)3COOH COOH 4
H COOCH3 14
Họ nấm Ganodermataceae gồm hơn 200 loài chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Các quả thể của một số loài nấm thuộc họ này đã đƣợc sử dụng trong y học truyền thống của Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc để điều trị nhiều bệnh khác nhau. Phân lập dịch chiết chloroform của Ganoderma colossum (FR.)
colossolactone I - VIII và các hợp chất đã biết nhƣ ergosterol, schisanlactone, và colossolactone B, C, D, E và G. Ngoại trừ colossolactone III, colossolactone VI, ergosterol và colossolactone C, tất cả các hợp chất còn lại đều ức chế protease HIV-1. Trong số đó, colossolactone I và II ức chế mạnh nhất với giá trị IC50 tƣơng ứng là 4,1 µM và 4,4 µM, các hợp chất cịn lại ức chế yếu hơn với IC50 từ 10,8- 29,1 µM [28, 29]. Tƣơng tự, các triterpenoid đƣợc phân lập từ nấm Linh chi đen (Ganoderma sinense Zhao, Xu et Zhang) ở Trung Quốc và Linh chi (Ganoderma
lucidum Karst) chẳng hạn nhƣ ganoderiol F, acid 20-hydroxylucidenic N, acid
ganoderic GS-2, và 20-acid dehydrolucidenic N cũng có hoạt tính kháng protease HIV với giá trị IC50 tƣơng ứng là 22 µM, 25 µM, 30 µM và 48 µM [66, 67]. Qua đây, có thể thấy rằng nhiều hợp chất triterpen có hoạt tính ức chế protease HIV-1.
Các hợp chất phenol: Tannin - một nhóm hợp chất phenol và các hợp chất
phenol liên quan khác có khả năng kháng virus hiệu quả. Thông thƣờng, các polyphenol này hoạt động bằng cách liên kết với các protein của các hạt virus và/hoặc bề mặt của tế bào chủ. Kết quả của quá trình này là ngăn ngừa hoặc làm giảm khả năng hấp phụ của virus lên màng tế bào chủ. Một số tannin có thể thủy phân nhƣ acid gallic và các galloyl glucose phân lập từ cây Chiêu Liêu (Terminalia chebula) và camellia-tannin H phân lập từ cây Trà My (Camellia
japonica) lần lƣợt thể hiện hoạt tính ức chế intergrase và protease HIV-1 mạnh.
Các curcumin phân lập từ dịch chiết ethyl acetate của thân rễ cây Nghệ (Curcuma longa) cũng cho thấy hoạt tính kháng protease HIV-1 và HIV-2 [69]. Từ dịch chiết
chloroform quả thể của nấm G. colossum ở Việt Nam đã phân lập đƣợc hai hợp
chất hydroquinone farnesyl là ganomycin B đã biết và hợp chất mới ganomycin I. Cả hai ganomycin I và ganomycin B ức chế protease HIV-1 với giá trị IC50 lần lƣợt tƣơng ứng 21,9 µM và 2,9 µM [30]. Các hợp chất phenol khác nhƣ catechin và epicatechin đều ức chế protease HIV-1 với IC50 ở nồng độ trên 100 μM [89]. Hai xanthone trong dịch chiết quả măng cụt là α-mangostin và -mangostin cũng ức chế hoạt độ protease HIV-1 theo cơ chế không cạnh tranh với giá trị IC50 tƣơng ứng là 5,12 0,41 μM và 4,81 0,32 μM [18].
Bên cạnh tác dụng ức chế trực tiếp protease HIV-1, việc tìm ra các hoạt chất này cũng s là cơ sở để thiết kế các chất hóa học có cấu trúc tƣơng tự nhƣng đƣợc cải biến phù hợp nhằm tăng hiệu quả ức chế protease HIV-1. Hiện nay, một số sản phẩm tự nhiên đã đƣợc sử dụng nhƣ là các hợp chất khuôn mẫu bởi hoạt tính ức chế mạnh và độc tính thấp của chúng. Một trong các ví dụ tiêu biểu phải kể đến là bevirimat (DSB, PA-457) hay acid 2,2-dimethyl succinic dẫn xuất của acid betulinic, đƣợc tạo ra trên cơ sở biến đổi cấu trúc của acid betulinic - acid đƣợc phân lập đầu tiên từ cây Trâm (Syzygium caviflorum) - một loại thảo dƣợc của Trung Quốc với hoạt tính ức chế HIV. Bevirimat hoạt động bằng cách gắn vào protein gag tiền thân và ngăn chặn quá trình phân cắt của protease HIV-1. Bevirimat đang đƣợc xem là một chất chống AIDS khá tiềm năng vì nó ức chế q trình sao chép của cả HIV-1 và HIV-1 kháng thuốc ức chế reverse transcriptase và protease [38]. Calanolide A đang đƣợc hãng Dƣợc phẩm Sarawak MediChem tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng HIV dài hạn trên lâm sàng. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy, calanolide A thể hiện khả năng hỗ trợ các chất ức chế reverse transcriptase và protease khác, đặc biệt là khi kết hợp với lamivudine và nelfinavir. Ngồi ra, chƣa có tƣơng tác phụ nào quan sát đƣợc trong quá trình thử nghiệm calanolide A [17]. Mặc dù, cho tới nay chƣa có loại thuốc nào có nguồn gốc tự nhiên đƣợc đƣa vào điều trị lâm sàng cho bệnh AIDS nhƣng hoạt động đầy hứa hẹn của các sản phẩm tự nhiên này đã đƣợc chứng minh. Xu hƣớng của các nghiên cứu tiếp theo s là tập trung phát triển và cải tiến các chất ức chế tự nhiên chẳng hạn nhƣ acid ursolic, acid maslinic… để tạo ra các thuốc có hiệu lực cao và an tồn nhằm mục đích đƣa vào thử nghiệm lâm sàng và tiền lâm sàng sớm cho điều trị HIV/AIDS.
Ở trong nƣớc, tác dụng sinh học của hai chế phẩm KVR1 (thành phần gồm sâm Ngọc linh sinh khối (Panax vietnamenis) và vỏ núc nác (Oroxylum indicum) và KVR2 (thành phần gồm sâm Ngọc linh sinh khối, quả nhàu (Morinda citrifolia) và cúc hoa vàng (Chrysanthemum indicum) cũng đƣợc đánh giá trên tế bào C8166 nhiễm HIV và tác dụng kháng HIV in vivo trên chuột chuyển gen [1]. Kết quả về
tác dụng kháng HIV in vitro cho thấy, hai chế phẩm ít gây độc cho tế bào ni cấy, có tác dụng làm giảm sự có mặt của virus, thể hiện qua tác dụng làm giảm
nồng độ gp120 so với nhóm chứng, ức chế sự tạo thành tế bào đa nhân (syncytia) ở những nồng độ cao. Trên in vivo, KVR1 làm giảm hàm lƣợng cDNA của HIV ở
các lô chuột uống KVR1 ở mức liều 400 và 600 mg/kg/ngày có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng [1].
Trong một nghiên cứu khác, Đỗ Thế Lộc và Phạm Viết Dự [3] đã đánh giá tác dụng hỗ trợ điều trị HIV/AIDS trên lâm sàng của bài thuốc y học cổ truyền MD 07. Bài thuốc bao gồm các vị thuốc: Hồng sâm, Hoàng kỳ, Quế nhục, Đƣơng quy, Cam thảo, Sa nhân, Thiên hoa phấn, Huyền sâm, Chỉ thực, Ngũ vị tử, Sinh địa, Mạch môn, Lô hội, Kim ngân hoa, Cỏ lƣỡi rắn và Phi đao kiếm. Bệnh nhân nghiên cứu đƣợc chia thành 2 nhóm: Nhóm 1 (nhóm chứng): gồm 30 bệnh nhân sử dụng phác đồ thuốc hóa dƣợc ARV bậc 1, thời gian điều trị trong vòng 6 tháng; nhóm 2 (nhóm nghiên cứu): sử dụng thuốc MD 07 kết hợp thuốc ARV bậc 1, thời gian điều trị trong 6 tháng. Kết quả lâm sàng, sau 3 tháng điều trị, cân nặng trung bình của nhóm sử dụng MD 07 tăng 1,49 kg, sau 6 tháng tăng 1,86 kg; nhóm khơng sử dụng MD 07 tăng 0,9 kg. Nhóm 2 cân nặng trung bình tăng gấp đơi nhóm 1 (p < 0,01). Sau 6 tháng điều trị chỉ số khối cơ thể (BMI) của nhóm 2 tăng 0,70 kg/m2; nhóm 1 tăng 0,35 kg/m2, BMI ở nhóm 2 tăng gấp 2 lần nhóm 1 (p < 0,05). Về các chỉ số xét nghiệm cận lâm sàng, trƣớc điều trị chỉ số CD4 dƣới 200 TB/mm3: nhóm 1 (80%), nhóm 2 (93%). Sau điều trị, chỉ số CD4 dƣới 200 TB/mm3 nhóm 1 cịn 53 %, nhóm 2 chỉ cịn 36,7 %, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Các chỉ số về nồng độ virus HIV, chỉ số sinh hóa máu và nƣớc tiểu của nhóm 2 đều cho các kết quả rất tích cực [3].
Ngồi ra, một số các nghiên cứu cũng đƣợc tiến hành để đánh giá tác dụng của viên nang Brishamin hay thuốc BSP1 trong hỗ trợ điều trị bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS [6, 7]. Nghiên cứu của Lã Đình Mỡi và Đái Duy Ban [5] điều tra đƣợc 40 lồi thảo mộc có tác dụng kháng virus, kháng HIV và tăng cƣờng miễn dịch có triển vọng ở Việt Nam. Đặc biệt, nghiên cứu cũng cho thấy một số hợp chất chính của lá cây Mù u (Calophyllum inophyllum) có hoạt tính kháng HIV cao và có triển vọng phát triển thành thuốc điều trị AIDS.
Khả năng ức chế protease HIV-1 của 8-hydroxyquinoline, menadione và acid asiatic cũng đƣợc phát hiện bởi Nguyễn Thị Hồng Loan và Phan Tuấn Nghĩa [56]. Ba hợp chất này ức chế protease HIV-1 với giá trị IC50 tƣơng ứng là 104 µM, 114,26 µM và 18,9 µM. Đây cũng là cơng trình đầu tiên phát hiện thấy tác dụng ức chế của các hợp chất này đối với protease HIV-1. Theo thống kê của Viện Dƣợc liệu, Việt Nam có hơn 12.000 lồi thực vật, trong đó có gần 4.000 lồi đƣợc dùng làm thuốc trong y học dân gian và y học cổ truyền. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng các cây thuốc Việt Nam có chứa nhiều hoạt chất có tác dụng sinh học đáng chú ý [24, 25, 79-81]. Nguồn thực vật phong phú và nhiều cây thuốc, vị thuốc của Việt Nam s là nguồn nguyên liệu phong phú cho việc sàng lọc và phát hiện ra các hoạt chất ức chế protease HIV-1, làm cở sở cho việc phát triển thuốc điều trị cho bệnh nhân HIV/AIDS.
Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU 2.1.1. Mẫu dƣợc liệu 2.1.1. Mẫu dƣợc liệu
Các mẫu thực vật, bao gồm: lá cây Thạch châu (Pyrenaria jonqueriana Pierre.), lá Ổi (Psidium guajava L.), cây Ma hoàng (Ephedra distachya L.) đƣợc thu hái và kiểm tra tính chính xác về lồi thơng qua đặc điểm hình thái bởi TS. Đỗ Thị Xuyến, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Mẫu nghiên cứu hiện đƣợc lƣu giữ tại Khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu.
2.1.2. Các hoá chất, nguyên liệu khác
Các hóa chất chính sử dụng cho nghiên cứu bao gồm: protease HIV-1 là sản phẩm của đề tài mã số: ĐT-PTNTĐ.2012-G/02; pepsin, hemoglobin, pepstatin A, dimethyl sulphoxide (DMSO), Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBB), cơ chất peptide L6525(Lys-Ala-Arg-Val-Nle-p-nitro-Phe-Glu-Ala-amide) đặc hiệu cho protease HIV-1 của Sigma-Aldrich (Mỹ), kit xác định hoạt tính protease HIV-1 sử dụng cơ chất huỳnh quang Kit SensoLyte® 520 HIV-1 Protease Assay (Anaspec, Mỹ).
Các hóa chất khác nhƣ trichloroacetic acid (TCA), agar, urea, β- mercaptoethanol… đều đạt độ tinh sạch dành cho phân tích.
2.2. MÁY MĨC VÀ TRANG THIẾT BỊ
Các máy móc, trang thiết bị chính sử dụng cho nghiên cứu bao gồm: tủ ấm 37ºC (Memmert, Anh); tủ an toàn sinh học cấp 2 (Nuaire, Mỹ); máy li tâm lạnh 5417R (Eppendorf, Đức); máy li tâm Sigma 3K (Sartorius, Đức); máy gia nhiệt khơ Multi Blok® Heater (Lab-Line Instruments, Hoa Kỳ); máy quang phổ (Thermo Scientific, Hoa Kỳ); máy quang phổ kiến DU 800 (Beckman coulter, Hoa Kỳ); máy NanoDrop huỳnh quang 3300 (Thermo Scientific, Hoa Kỳ).
Các dụng cụ, trang thiết bị cơ bản khác của phòng Protein tái tổ hợp thuộc Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzyme và Protein.
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phân tách các hợp chất từ dịch chiết thực vật
- Lá dƣợc liệu (1,5 kg) độ ẩm 8,5% đƣợc cắt nhỏ, chiết hồi lƣu với ethanol 96% ở nhiệt độ sôi (chiết 3 lần, mỗi lần 4 giờ).
- Dịch chiết đƣợc gộp lại và cất loại dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc cao chiết ethanol đã cô khô.
- Cao chiết đƣợc hịa tan vào nƣớc cất (0,5 lít) thành nhũ dịch và tiếp tục chiết phân đoạn lần lƣợt với các dung mơi có độ phân cực tăng dần theo thứ tự n- hexan (Hx) (0,5 lít × 3 lần), ethyl acetate (EtOAc) (0,5 lít × 3 lần), n-butanol (BuOH) (0,5 lít × 3 lần).
- Các dịch chiết Hx, EtOAc và BuOH đƣợc tách riêng, cất loại dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc các phần cao tƣơng ứng.
- Cao phân đoạn có hoạt tính ức chế tốt tiếp tục đƣợc chạy qua cột sắc ký silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi dicloromethan/methanol với tỷ lệ methanol tăng dần từ 0 đến 100%.
- Thành phần dịch rửa giải đƣợc kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng. Sự có mặt của các hợp chất quan tâm đƣợc quan sát bản sắc ký dƣới đèn tử ngoại ở bƣớc sóng UV - 254 nm, 365 nm và ánh sáng trắng sau khi phun thuốc thử H2SO4 10%/ethanol và sấy ở 110oC trong 5 phút.
- Phân đoạn lựa chọn đƣợc chạy qua cột silica gel rửa giải với hệ dung môi gradient n-hexan/ethyl acetat (4/1; 2/1; 1/1) thu đƣợc hợp chất quan tâm.
2.3.2. Xác định cấu trúc của chất đƣợc phân tách
Công thức cấu tạo của chất phân tách đƣợc xác định thơng qua các tính chất lý hóa (cảm quan, nhiệt độ nóng chảy) và các phổ tử ngoại (UV), hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1
H-NMR, 13C-NMR, DEPT, sử dụng chất nội chuẩn là TMS - tetramethyl silan) và so sánh với các dữ liệu đã cơng bố.
2.3.3. Xác định hoạt tính ức chế pepsin bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch có chứa cơ chất hemoglobin thạch có chứa cơ chất hemoglobin
Trong giai đoạn sàng lọc ban đầu, hoạt tính ức chế protease HIV-1 của các dịch chiết thực vật đƣợc đánh giá gián tiếp thông qua khả năng ức chế pepsin phân giải cơ chất hemoglobin [2]. Quá trình chuẩn bị đĩa thạch gồm các bƣớc nhƣ sau:
1. Các đĩa agar (2,5%) đƣợc chuẩn bị trong đệm acetate 50 mM pH 3,5, chứa hemoglobin (0,3%) và đƣợc đục các lỗ (đƣờng kính 4 mm) để cho mẫu phân tích. 2. 10 µl dịch chiết thực vật hoặc các phân đoạn tinh sạch pha trong DMSO đƣợc cho vào giếng, ủ 37ºC trong 15 phút cho đến khi dịch chiết khuếch tán một phần vào đĩa thạch.
3. 10 µl pepsin (1 mg/ml) pha trong HCl 0,01 N đƣợc bổ sung và tiếp tục ủ ở 37ºC trong 2 giờ. Mẫu kiểm tra âm là mẫu thay đồng thời dịch chiết bằng DMSO, thay pepsin bằng dung dịch pha pepsin (HCl 0,01 N), mẫu kiểm tra dƣơng là mẫu chỉ thay dịch chiết (chứa chất ức chế) bằng DMSO.
4. Sau khi ủ 120 phút, đĩa thạch đƣợc nhuộm bằng dung dịch CBB 0,25% và đƣợc tẩy nhiều lần cho tới khi nhìn rõ vịng phân giải của pepsin.
Hoạt tính ức chế pepsin đƣợc đánh giá trên cơ sở đo vòng phân giải cơ chất, so sánh giữa mẫu thí nghiệm và các mẫu kiểm tra. Đƣờng kính vịng phân giải càng bé thì hoạt tính ức chế của dịch chiết càng tốt. Cụ thể, khả năng ức chế của các hợp chất thực vật đƣợc thống kê trên cơ sở (Bảng 2.1.).
Bảng 2.1. Mức độ ức chế pepsin của các hợp chất thực vật theo đƣờng kính vịng phân giải Đƣờng kính vịng phân giải (ĐKVPG) (cm) Mức độ ức chế 0 < ĐKVPG ≤ 0,6 cm +++ 0,6 < ĐKVPG ≤ 0,9 ++ 0,9 < ĐKVPG < 1,1 + 1,1 ≤ ĐKVPG - (Không ức chế)
2.3.4. Xác định hoạt tính ức chế pepsin theo phƣơng pháp Anson cải tiến
Bên cạnh phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch, hoạt tính ức chế pepsin của các dịch chiết thực vật cũng đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp Anson cải tiến với cơ chất hemoglobin theo quy trình mơ tả của hãng Sigma Aldrich [94].
Nguyên tắc: Hemoglobin bị phân cắt bởi pepsin thành các peptide và acid amin hòa tan. Phần cơ chất dƣ thừa đƣợc loại bỏ bằng kết tủa và ly tâm. Sự có mặt của các acid amin thơm trong sản phẩm thủy phân đƣợc xác định thông qua độ hấp thụ của chúng ở bƣớc sóng 280 nm (A280) và là cơ sở để đánh giá hoạt độ của pepsin. Khi có mặt của chất ức chế, hoạt độ phân giải hemoglobin giảm đi so với mẫu khơng có chất ức chế.
Cách tiến hành: Pepsin đƣợc ủ với dịch chiết thực vật ở 37ºC, 5 phút. Sau đó bổ sung hemoglobin 2% trong HCl 60 mM và tiếp tục ủ ở 37ºC trong 15 phút. Phản ứng đƣợc làm ngừng bằng cách bổ sung TCA 5%, sản phẩm phân giải trong dịch nổi thu đƣợc sau khi ly tâm đƣợc xác định bằng cách đo độ hấp thụ ánh sáng ở 280 nm (A280). Mẫu kiểm tra là pepsin bị bất hoạt bằng TCA 5%
trƣớc khi bổ sung cơ chất. Hoạt độ pepsin đƣợc đánh giá trên cơ sở hiệu số số đọc A280 của mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm tra.
Cơng thức tính % ức chế:
Trong đó: AĐC và ATN lần lƣợt là độ hấp thụ tại bƣớc sóng 280 nm của mẫu đối chứng và mẫu thí nghiệm.
2.3.5. Xác định hoạt tính protease HIV-1 sử dụng cơ chất peptide đặc hiệu
Hoạt tính ức chế protease HIV-1 của các hợp chất đƣợc xác định bằng cách sử dụng cơ chất tổng hợp có liên kết đặc hiệu dựa theo phƣơng pháp đƣợc mô tả bởi Richards và tập thể [64].
Nguyên tắc: Cơ chất peptide với trình tự Lys-Ala-Arg-Val-Leu*Nph-Glu-Ala-
Met (Sigma-Aldrich) chứa vị trí phân cắt của protease HIV-1 dƣới dạng cải biến Nle
% ức chế =
AĐC - ATN AĐC
(nonleucine) và 4-NO2- phenylalanine (Nph) có khả năng hấp thụ ánh sáng cực đại ở bƣớc sóng 300 nm (A300). Dƣới tác dụng thủy phân của protease HIV-1 liên kết bị phân giải, đo độ giảm A300 theo thời gian trên máy quang phổ kế UV-VIS.
Cách tiến hành: