Phương pháp biến nạp được tiến hành như sau:
- Lấy tế bào khả biến vi khuẩn E.Coli DH5α từ -80⁰C, để trên đá 5 phút
cho hỗn hợp trong ống thành dạng lỏng.
- Bổ sung 5µL hỗn hợp nối (ligate). Dùng ngón tay đập nhẹ vào thành ống để trộn đều plasmid và tế bào khả biến. Để ống trong đá khoảng 15 phút.
- Sốc nhiệt hỗn hợp ở 42⁰C trong 45 giây, để lại trên đá 3 phút.
- Bổ sung 1 ml môi trường LB, ủ 370C trong 15 phút, lắc 200 vòng/phút ở 370C trong 1 giờ.
- Ly tâm hỗn hợp ở nhiệt độ phòng, 3000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ 900 µl dịch phía trên.
- Hịa tan phần tủa bằng 100µl dung dịch cịn lại và trải trên đĩa thạch LB có bổ sung ampicillin (50µg/ml).
2.2.8.3. Sàng lọc khuẩn lạc bằng PCR và RFLP
Sau khi tế bào khả biến được biến nạp và cấy trải trên đĩa thạch LB đặc có bổ sung Ampicillin để qua đêm ở tủ ấm 370C, những khuẩn lạc nào mọc trên đĩa thạch sẽ được kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp mồi MP9 (Bảng 11) hoặc với cặp mồi pJet1.2 (Bảng 12) để nhân đúng kích thước đoạn gen cần biến nạp có trong tế bào vi khuẩn. Nếu PCR khuẩn lạc, sản phẩm được điện di cho băng kích
thước 596bp thì chứng tỏ đã biến nạp thành công đoạn gen vào tế bảo E.coli
DH5α.
Bảng 11: Thành phần mỗi phản ứng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi MP9 Thành phần Thể tích (l) Nồng độ cuối cùng
Master Mix 2x 6,25 1X
Primer F 10µM 0,25 0,2 M
Primer R 10µM 0,25 0,2 M
Nước 5,75
Trộn đều hỗn hợp, cho 1 khuẩn lạc vào hỗn hợp trộn đều. Chạy PCR với 35 chu kỳ, chu trình nhiệt đã được thể hiện ở hình 4.
Bảng 12: Thành phần mỗi phản ứng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi pJet1.2 Thành phần Thể tích (l) Nồng độ cuối cùng
Master Mix 2x 6,25 1X
Primer F 10µM 0,25 0,2 M
Primer R 10µM 0,25 0,2 M
Nước 5,75
Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,7%, nhuộm EtBr và được nhận biết bằng tia UV bước sóng 245nm
2.2.8.4. Tách chiết plasmid
Tách chiết và tinh sạch ADN plasmid là một bước thí nghiệm quan trọng trong các nghiên cứu nhân dòng phân tử cũng như trong hàng loạt nghiên cứu khác của lĩnh vực sinh học phân tử. Các plasmid thường được tinh sạch từ môi trường nuôi cấy dịch thể được chuẩn bị bằng cách nuôi cấy một khuẩn lạc đơn mang plasmid (thể biến nạp). Có rất nhiều phương pháp được sử dụng hiện nay
để tách chiết ADN plamid. Phương pháp dưới đây cho phép thu nhận chế phẩm ADN plamid ở dạng tương đối sạch. Nguyên lý của phương pháp này dựa vào lợi thế của việc biến tính bằng kiềm đối với ADN plasmid và ADN nhân và sự hồi tính một cách chọn lọc ADN plasmid sau khi trung hòa dung dịch. ADN được tách chiết có thể được sử dụng trong các phản ứng cắt bằng enzym giới hạn, nhân dịng và đọc trình tự.
Tiến hành tách plasmid: Sử dụng bộ kit QIA prep Miniprep kit, thực hiện ở nhiệt độ phòng. Các bước tiến hành:
- Lấy 1 khuẩn lạc đã được kiểm tra bằng PCR có chứa đoạn chèn trên đĩa thạch cho vào 1-5ml mơi trường LB lỏng có chứa ampicillin. Lắc ni cấy qua đêm 12-16h ở 370C. Sau đó:
- Thu cặn tế bào: Ly tâm 8000 vòng/phút, 3 phút, loại bỏ dịch nổi, thu cặn. - Hịa cặn trong 250µl dung dịch P1, vortex nhẹ.
- Thêm 250µl dung dịch P2 đảo nhẹ, không để quá 2 phút.
- Thêm 350µl dung dịch N3 đảo nhẹ, ly tâm 13000 vòng/phút, 10 phút, thu được tủa.
- Hút dịch cho lên cột, ly tâm 13000 vòng/phút, 1 phút, loại bỏ dịch dưới cột.
- Thêm 0,75ml dung dịch PE và ly tâm 13000 vòng/phút, 1 phút, loại bỏ dịch dưới cột.
- Thu ADN: Đặt cột lên ống li tâm 1,5ml mới. Cho 100µl dung dịch EB lên cột, để cột đứng yên 1 phút, ly tâm 13000 vòng/phút, 1 phút. Thu dịch.
- Điện di kiểm tra dịch thu được trên gel agarose 0,8%. 2.2.9. Xử lý số liệu và tính tốn thống kê
Xử lý các số liệu, kết quả thu được theo các phương pháp thống kê thường dùng. So sánh các đặc trưng thống kê mẫu bằng phép thử χ² với mức ý nghĩa α = 0,05.
Trình tự promoter gen MMP-9 đã được so sánh, phân tích với trình tự gen
MMP-9 đã được cơng bố trên các Ngân hàng trình tự gen Quốc tế EMBL (EBI)/Genbank/ DDBJ bằng các phần mềm tin sinh học chuyên dụng như BioEdit, BLAST, ClustalX…
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả phân tích biến đổi gen MMP-9 từ mẫu mô của bệnh nhân UTĐTT
3.1.1. Kết quả phân tích biến đổi của gen MMP-9 bằng kỹ thuật PCR-RFLP
Sau khi điện di kiểm tra ADN tổng số trên gel Agarose 1%, chúng tôi nhận thấy các băng ADN tổng số tương đối sáng, gọn. Đồng thời, khi tiến hành đo độ hấp thụ ánh sáng tia tử ngoại của ADN tổng số để đánh giá độ tinh sạch cũng như lượng ADN bằng máy đo quang phổ Nano Drop. Kết quả cho thấy các mẫu ADN đều có chỉ số A260/ A280 nằm trong khoảng 1,8-2,0. Chứng tỏ lượng ADN trong mẫu thu được là sạch đủ điều kiện để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Sử dụng cặp mồi đặc hiệu MP9 với khuôn là ADN tổng số được tách từ mơ, khuếch đại đoạn gen có kích thước lý thuyết 596bp bằng phản ứng PCR. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,7% nhuộm EtBr, quan sát dưới tia UV bước sóng 245nm. Kết quả điện di được thể hiện như trong hình 6.
Hình 6: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR promoter gen MMP-9 từ ADN tổng số tách từ mô
Giếng 1: Thang chuẩn ADN 100bp
Giếng 2-3: Sản phẩm PCR từ mẫu mô lân cận u và mẫu mô u của bệnh nhân mã 39799 Giếng 4-5: Sản phẩm PCR từ mẫu mô lân cận u và mẫu mô u của bệnh nhân mã 36474 Giếng 6-7: Sản phẩm PCR từ mẫu mô lân cận u và mẫu mô u của bệnh nhân mã 37456 Giếng 8: Sản phẩm PCR từ mẫu mô lân cận u của bệnh nhân mã 42440
Kết quả điện di cho thấy đã thu được sản phẩm PCR có kích thước khoảng 596bp, phù hợp với lý thuyết. Các băng rõ nét và không xuất hiện băng phụ, chứng tỏ khơng có hiện tượng bắt cặp khơng đặc hiệu.
Để xác định những biến đổi trong vùng promoter gen MMP-9, chúng tôi tiến hành cắt sản phẩm PCR đoạn ADN trên promoter MMP-9 đã khuếch đại thành công bằng enzyme giới hạn SphI.
Trên lý thuyết, với những mẫu chứa biến đổi C thành T tại vị trí -1562
trên vùng promoter gen MMP-9 thì đoạn ADN có kích thước 596 bp sẽ chứa
trình tự nhận biết của enzyme giới hạn, kết quả là đoạn ADN sẽ bị cắt thành hai đoạn nhỏ với kích thước lần lượt là 358bp và 238bp, khoảng cách giữa hai băng là 120bp. Ngược lại, những mẫu khơng có biến đổi sẽ giữ nguyên kích thước. Sản phẩm của quá trình cắt enzyme được điện di kiểm tra cùng với sản phẩm PCR trên gel Agarose 1,7% nhuộm EtBr và được quan sát dưới tia UV bước sóng 245nm (Hình 7).
Hình 7: Hình ảnh điện di kết quả cắt enzyme sản phẩm PCR từ ADN tổng số của mô Giếng 1: Thang chuẩn ADN 100bp
Giếng 2-3: Sản phẩm PCR và sản phẩm cắt enzyme giới hạn từ mẫu mô lân cận u của bệnh nhân mã 3035 (chỉ xuất hiện biến đổi ở mẫu mô lân cận u)
Giếng 4-5: Sản phẩm PCR và sản phẩm cắt enzyme giới hạn từ mẫu mô u của bệnh nhân mã 41767 (chỉ xuất hiện biến đổi ở mẫu mô u)
Giếng 6-7 : Sản phẩm PCR và sản phẩm cắt enzyme giới hạn từ mẫu mô lân cận u của bệnh nhân mã 4841 (enzyme cắt khơng hồn tồn)
Giếng 8-9: Sản phẩm PCR và sản phẩm cắt enzyme giới hạn từ mẫu mô u của bệnh nhân mã 4841 (enzyme cắt khơng hồn tồn)
Giếng 10-11: Sản phẩm PCR và sản phẩm cắt enzyme giới hạn từ mẫu mô lân cận u của bệnh nhân mã 38784 (enzyme cắt hoàn toàn)
Giếng 12-13: Sản phẩm PCR và sản phẩm cắt enzyme giới hạn từ mẫu mô u của bệnh nhân mã 38784 (enzyme cắt hồn tồn)
Từ kết quả trên hình 7, chúng tơi đã nhận thấy sản phẩm PCR sau khi cắt
bằng enzyme SphI trên bản điện di xuất hiện hai băng có kích thước khoảng
358bp và 238bp nên được dự đốn là có xuất hiện biến đổi C→T trong đoạn ADN nghiên cứu. Chúng tôi tiếp tục tiến hành cắt enzyme với mẫu của 99 bệnh nhân ( bao gồm mẫu mô u và mẫu mơ lân cận u), kết quả thu được có 19 bệnh nhân khi điện di sản phẩm cắt thu được hai băng có kích thước tương tự như hình 7. Từ kết quả thu được, chúng tơi tiến hành so sánh với trình tự tham khảo, và có thể kết luận rằng: Có sự xuất hiện biến đổi C thành T tại vị trí -1562 trên vùng
promoter gen MMP-9 trong các mẫu nghiên cứu. Ngồi ra chúng tơi còn nhận
thấy, khi sử dụng enzyme cắt thì sản phẩm PCR được cắt khơng hồn tồn, tức là xuất hiện 3 băng có kích thước lần lượt khoảng 596bp, 358bp và 238bp. Điều này có thể do xuất hiện hiện tượng dị hợp tử trong các mẫu có xuất hiện biến đổi. 3.1.2. Kết quả giải trình tự trực tiếp và nhân dịng
Kết quả giải trình tự trực tiếp
Sau khi được tinh sạch, sản phẩm PCR được giải trình tự trực tiếp với mồi xuôi của cặp mồi MP9.
Chúng tôi chọn 20 mẫu có biến đổi (khi phân tích bằng PCR-RFLP thu được 2 băng 358bp và 238bp) để giải trình tự trực tiếp thì có 18 mẫu thấy xuất hiện dị hợp tử CT (có cả C và T tại cùng một vị trí), cịn hai mẫu chỉ xuất hiện đồng hợp tử TT (đây là mẫu mô u và mô lân cận u của cùng một bệnh nhân).
Sử dụng phần mềm BioEdit và Clustal X để phân tích kết quả giải trình tự và sử dụng chương trình BLAST để so sánh trình tự thu được với trình tự ADN
tham khảo của gen MMP-9 đã được công bố trên ngân hàng gen NCBI (NG_011468.1), chúng tơi đã xác định được các vị trí biến đổi trên gen MMP-9.