Giếng 4: Thang chuẩn ADN 100bp
Giếng 1-3: Sản phẩm PCR từ mẫu máu người bình thường cho máu (mã 29079, 29085, 29093) Giếng 5-7: Sản phẩm PCR từ mẫu máu bệnh nhân UTĐTT (bệnh nhân mã 10626, 17401, 16689)
3.2.2. Kết quả phân tích RFLP đoạn gen chứa biến đổi trong vùng
promoter gen MMP-9
Tương tự như mẫu mô, sau khi khuếch đại được đoạn ADN chứa vị trí
biến đổi -1562, chúng tơi cũng tiến hành cắt sản phẩm PCR bằng enzyme SphI.
Như trong hình ảnh, nếu xuất hiện biến đổi C-1562T thì enzyme cắt sản phẩm PCR thành hai băng với kích thước lý thuyết là 358bp và 238bp. Ngược lại nếu khơng xuất hiện biến đổi thì sản phẩm PCR khơng bị cắt và kích thước lý thuyết bằng 596bp. Thực hiện ở mẫu máu của 14 bệnh nhân ung thư đại trực tràng, chúng tơi phát hiện được 2 mẫu có chứa biến đổi C→T tại vị trí -1562. Như vậy biến đổi C-1562T cũng xuất hiện ở mẫu máu người bệnh. Thực hiện ở mẫu máu của 30 người bình thường cho máu, chúng tơi phát hiện được 9 mẫu có chứa biến đổi C →T tại vị trí -1562. Như vậy biến đổi C-1562T cũng xuất hiện ở mẫu máu của người khỏe mạnh. Hình ảnh kết quả cắt enzyme được thể hiện ở hình 16.
Hình 16: Hình ảnh cắt enzyme giới hạn sản phẩm PCR từ mẫu máu người bình thường cho máu và mẫu máu bệnh nhân UTĐTT
Giếng 1: Băng chuẩn ADN 100bp
Giếng 2-3: Sản phẩm PCR và sản phẩm cắt enzyme từ mẫu máu của người bình thường cho máu (mã 29093)
Giếng 4-5: Sản phẩm PCR và sản phẩm cắt enzyme từ mẫu máu của bệnh nhân mã 16756
Để đánh giá sự xuất hiện của biến đổi C-1562T trên các vị trí mơ khác nhau ở cùng một bệnh nhân UTĐTT, tiến hành nghiên cứu và phân tích ADN ở mẫu mô lân cận u, mẫu mô u và mẫu máu của cùng một bệnh nhân. Kết quả được thể hiện ở hình 17.
Hình 17: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RE mẫu mô u-mô lân cận u và mẫu máu của cùng một bệnh nhân (mã 16678)
Giếng 1: Thang chuẩn ADN 100bp
G2-3: Sản phẩm PCR và sản phẩm cắt enzym của mẫu mô lân cận u G4-5: Sản phẩm PCR và sản phẩm cắt enzyme của mẫu mô u G6-7: Sản phẩm PCR và sản phẩm cắt enzyme của mẫu máu
Như trên hình 17, sản phẩm PCR từ mẫu mô lân cận u không bị cắt bằng enzyme, chỉ xuất hiện 1 băng có kích thước khoảng 596bp, mẫu mơ u được cắt tạo 2 băng với kích thước khoảng 358bp và 238bp, còn mẫu máu thì cũng chỉ xuất hiện một băng với kích thước khoảng 596bp. Như vậy, biến đổi chỉ xuất hiện ở mẫu mô u mà không xuất hiện ở mẫu mô lân cận u và mẫu máu. Từ kết quả này, chúng tơi dự đốn đây là biến đổi C-1562T có thể là biến đổi soma.
3.3. Phân tích mối liên hệ giữa biến đổi C-1562T với một số đặc điểm bệnh học của bệnh nhân UTĐTT bệnh học của bệnh nhân UTĐTT
Kết quả phân tích PCR-RFLP kết hợp cùng với giải trình tự của 198 mẫu ADN tổng số của 99 bệnh nhân UTĐTT đã cho thấy có xuất hiện biến đổi C thành T
xuất hiện thể đồng hợp tử TT. Khi phân tích mối liên quan giữa biến đổi C-1562T, cũng như tần suất xuất hiện của hai alen C và T trên đoạn ADN nghiên cứu thuộc
vùng promoter gen MMP-9 của 99 bệnh nhân UTĐTT với một số đặc điểm bệnh
học của bệnh nhân, chúng tôi thu được kết quả như bảng 13 và bảng 14.
Bảng 13: Phân bố biến đổi C-1562T của promoter gen MMP-9 ở bệnh nhân ung thư đại
trực tràng theo một số đặc điểm bệnh học của bệnh
Đặc điểm Tỷ lệ(%)
CC CT+TT
Vị trí mơ Mơ lân cận u (92) 84,78 (78) 15,22 (14)
Mô u (94) 84,04 (79) 15,96(15) Tuổi <50 (25) 76 (19) 24 (6) ≥50 (72) 81,94(59) 18,06(13) Giới tính Nam (47) 74,47(35) 17,02(8) Nữ (52) 78,84(41) 21,16 (11) Vị trí ung thư Đại tràng (42) 80,95(34) 19,05(8) Trực tràng (50) 78(39) 22(11) Giữa ĐT và TT (7) 100(7) 0(0) Kích thước u <3 (39) 79,49(31) 20,51(8) ≥3 (42) 85,71(36) 14,29(5) Phân loại TNM Giai ðoạn I: T1-2N0M0 Giai ðoạn II: T3-4N0M0 (59)
81,36(48) 18,64(11)
Giai ðoạn III: N1-2M0T bất kỳ Giai ðoạn IV: M1T, N bất kỳ (40)
80(32) 20(8)
Ghi chú: Số trong ngoặc đơn là số lượng bệnh nhân được nghiên cứu
Phân bố biến đổi C-1562T trên promoter gen MMP-9 ở bệnh nhân