Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel Agarose 1,7%, nhuộm EtBr. Quan sát và chụp ảnh trên máy soi tử ngoại.
2.2.4. Phương pháp RFLP
Phương pháp RFLP sử dụng các enzyme giới hạn thích hợp phân cắt sản phẩm PCR để nhận biết biến đổi qua phổ băng điện di.
Với đoạn ADN có chứa vị trí -1562 trên vùng promoter gen MMP-9, chúng tơi sử dụng Enzyme FastDigest® SphI. Enzyme này có vị trí nhận biết trên
ADN như sau:
5’…GCATG/C…3’ 3’…C/GTACG…5’
Khi phân tích vị trí nhận biết của enzyme giới hạn trên đoạn ADN có kích thước 596bp, chúng tôi nhận thấy: Trong trường hợp -1562C thì đoạn ADN
khơng bị enzyme SphI cắt và sản phẩm có kích thước là 596bp, trong trường hợp -1562T thì đoạn ADN bị enzyme ShpI cắt tại 1 vị trí duy nhất tạo 2 đoạn ADN có
kích thước lần lượt là 358bp và 238bp.
Sản phẩm PCR được tiến hành phản ứng cắt với enzyme thích hợp theo
hướng dẫn của nhà sản xuất. Thành phần phản ứng cắt enzyme SphI được trình
bày ở bảng 8
Bảng 8: Thành phẩn phản ứng cắt sử dụng enzyme giới hạn SphI
Thành phần Thể tích
10X FastDigestđ buffer 2àl Sn phm PCR (~0.2 àg) 10àl
FastDigestđ enzym SphI 1àl
Nc B sung đến đủ 30 µl
Thành phần phản ứng sau khi được trộn đều và ly tâm nhẹ sẽ được ủ ở 37⁰C trong bể ổn nhiệt 15 phút, bất hoạt enzyme ở 65⁰C. Sản phẩm sau khi cắt sẽ được tiến hành điện di kiểm tra trên gel Agarose 1,7% và được nhuộm EtBr, được quan sát và chụp ảnh trên máy soi tử ngoại.
2.2.5. Điện di
Điện di là một trong số các phương pháp được sử dụng phổ biến nhất trong các nghiên cứu hóa sinh để nhằm mục đích phân tách các hợp chất. Ngồi ra điện di có thể dùng trong đánh giá độ tinh sạch hay nhận dạng một số hợp chất quan tâm.
Điện di gel agarose được thực hiện với chất nền là agarose. Nồng độ agarose dùng trong điện di nằm trong khoảng 0,5 – 2,5%. Nồng độ gel cao hay thấp hơn giới hạn này là rất khó thao tác vì gel hoặc quá mềm, hoặc quá rắn.
Chuẩn bị bản gel 1% để: Kiểm tra ADN tổng số, kiểm tra sản phẩm PCR, tinh sạch ADN…
- Cân 1 g Agarose dạng bột (invitrogen), bổ sung thêm 100 ml đệm chạy TBE 1X pH 8,3 (Tris-base 0,09M; axit boric 0,09M, EDTA 4mM).
- Cho vào lị vi sóng đun cho đến khi agarose tan hồn tồn, tạo thể dịch thống nhất.
- Để nguội đến khoảng 60⁰C và đổ vào bể điện di có cài sẵn lược. - Sau 30-40 phút, khi gel đã đông cứng, gỡ lược ra.
- Sản phẩm cần điện di kiểm tra sẽ được trộn với loading dye với tỷ lệ thích hợp và được tra lên giếng điện di. Điện di với dòng điện 110V trong khoảng thời gian thích hợp (kiểm tra sản phẩm PCR khoảng 30 phút, kiểm tra ADN tổng số khoảng 60 phút).
- Sau khi điện di xong nhẹ nhàng lấy bản gel ra khỏi bể điện di, ngâm vào dung dịch EtBr trong 20-30 phút và quan sát dưới tia UV.
2.2.6. Tinh sạch sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR cần tinh sạch để giải trình tự. Phản ứng PCR được tiến hành với thể tích lớn 75 µl, sau đó sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% và nhuộm bằng EtBr. Quan sát và cắt băng sản phẩm PCR trên máy soi gel.
Tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR sử dụng kit thơi gel QIAquick® Gel Extraction Kit theo đúng quy trình của nhà sản xuất.
- Cắt băng sản phẩm PCR ra khỏi bản gel agarose bằng dao sạch và sắc, bỏ vào ống li tâm 1,5 ml mới.
- Cân khối lượng mảnh gel vừa cắt (khối lượng mảnh gel nên nhỏ hơn 0,4g). Bổ sung 3 lần thể tích đệm QG vào ống mẫu với 1 thể tích gel (tỷ lệ 0,1 g ~ 100 µl QG).
- Ủ ở 50⁰C trong 10 phút, khoảng 2-3 phút lại trộn đều ống mẫu để mảnh gel tan hoàn toàn. Sau khi mảnh gel đã tan hoàn toàn, quan sát màu sắc của dịch trong ống, dịch phải có màu vàng tương tự như màu của đệm QG. Nếu dịch có
màu cam hoặc màu tím thì bổ sung 10 µl 3M Sodium acetate, pH 5,0, trộn đều cho đến khi dịch có màu vàng.
- Thêm 1 thể tích isopropanol vào ống mẫu và trộn đều.
- Cho dịch lên cột ly tâm 13000 vịng trong 1 phút, bỏ dịch. Nếu mẫu có thể tích lớn hơn 800 µl thì phải lên cột nhiều lần, cho đến khi hết dịch trong ống mẫu.
- Bổ sung 500 µl đệm QG vào cột , ly tâm 13000 vòng trong 1 phút. Bỏ dịch. - Rửa cột: Cho 750 đệm PE vào cột, để 2-5 phút ở nhiệt độ phịng, sau đó ly tâm 13000 vòng trong 1 phút. Bỏ dịch rồi ly tâm lại một lần nữa cho hết sạch dịch trên cột.
- Cho cột sang ống li tâm 1,5ml mới, sạch.
- Cho 50 µl đệm Elution Buffer vào trung tâm màng cột để thôi ADN ra khỏi cột, ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng, ly tâm 13000 vòng trong 1 phút.
- Bảo quản ADN tinh sạch vừa thu được ở -20⁰C
Kiểm tra độ tinh sạch của ADN bằng điện di và đo nồng độ ADN bằng máy đo quang phổ Nano Drop.
2.2.7. Giải trình tự trực tiếp
Từ những năm 1970, trình tự các nucleotide trên phân tử ADN được xác định một cách đơn giản và nhanh chóng nhờ sự ra đời cả hai phương pháp khác nhau: Phương pháp hóa học và phương pháp enzyme. Tuy nhiên từ những năm cuối của thập kỷ 20 thế kỷ XX, trình tự nucleotide được xác định trên máy đọc tự động ngày càng phổ biến. Trên các máy đọc tự động hiện đại, thông thường bốn loại nucleotide được đánh dấu bằng các chất phát huỳnh quang khác nhau. Đầu đọc laser trong máy sẽ kích hoạt các chất này khiến chúng hấp thụ và phát ra các màu, mỗi màu ứng với một loại nucleotide và được hiển thị bằng một đỉnh. Ưu điểm của phương pháp này là kết quả đọc được đưa trực tiếp vào chương trình máy tính, giảm bớt các sai sót do đọc bằng mắt gây ra.
2.2.8. Nhân dòng phân tử
Nhân dịng phân tử là một nhóm các phương pháp nhằm:
- Phân lập một đoạn ADN đặc hiệu từ một hỗn hợp các phân tử ADN ban đầu được tách chiết từ các mẫu sinh học có thành phần phức tạp.
- Nhân bản đoạn trình tự ADN được quan tâm lên một lượng đủ lớn để có thể tiến hành phân tích về cấu trúc và chức năng ADN tương ứng.
Tiến hành: Sử dụng CloneJET PCR Cloning Kit 2.2.8.1. Cài ADN vào vector Pjet 1.2
Tiến hành phản ứng nối trên đá
Bảng 9: Thành phần phản ứng tạo đầu bằng
Thành phần Thể tích
2X Reaction buffer 5µl
Sản phẩm PCR 0.5µl
Nýớc 3µl
Enzym tạo ðầu bằng 0.5µl
Tổng thể tích 9µl
Trộn đều hỗn hợp, ủ hỗn hợp phản ứng ở 70⁰C trong 5 phút. Thực hiện phản ứng nối trên đá, bổ sung vào hỗn hợp các thành phần như trong bảng 10.
Bảng 10: Thành phần phản ứng chèn sản phẩm PCR vào vector
Thành phần Thể tích
Sản phẩm PCR ðã tạo ðầu bằng 9 µl pJET1.2/blunt Cloning Vector (50
ng/µl) 0.5µl
T4 ADN ligase 0.5 µl
Tổng thể tích 10µl
Ủ hỗn hợp nối ở nhiệt độ phòng 22⁰C trong 5 phút.
2.2.8.2. Biến nạp vector Pjet1.2 vào vi khuẩn E.coli DH5α
Biến nạp gen là bước quan trọng trong ứng dụng nhân dòng sản xuất nhiều bản sao giống nhau từ một gen “đích” (gen mong muốn nhân dòng). Vector nhân dịng phải thỏa mãn các điều kiện: có tâm tái bản, có gen chọn lọc, có vị trí đa điểm chứa vị trí cắt của nhiều enzym giới hạn. Các vector được biến nạp vào tế bào khả biến để nhân lên nhiều bản sao của vector đó. Tế bào nhận vector được gọi là biến nạp. Thể biến nạp được phát hiện nhờ sự biểu hiện của các gen chứa trong vector đó, thường là các gen kháng kháng sinh. Bên cạnh gen chọn lọc thể biến nạp, các vector plasmid được thiết kế thêm các gen sàng lọc.
Chúng tôi tiến hành biến nạp plasmid pJET 1.2 chèn đoạn ADN có kích thước
596bp vào tế bào khả biến E.coli DH5α. Các tế bào được nhận plasmid sẽ mọc
thành khuẩn lạc trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh Ampicillin. Các tế bào khơng có plasmid sẽ khơng sinh trưởng được trên mơi trường này.
Vector plasmid pJET 1.2 có kích thước 2974bp. Vị trí đa điểm của vector được thiết kế nằm trong gen mã hóa cho một protein gây độc cho vi khuẩn (Hình 5).