Hình a: Trường hợp dị hợp tử CT (Bệnh nhân mã 4841) Hình b: Trường hợp đồng hợp tử TT (Bệnh nhân mã 38784)
Từ kết quả giải trình tự trực tiếp, so sánh với trình tự tham khảo trên ngân hàng gen đã được công bố trong NCBI, chúng tơi xác định được chính xác vị trí
biến đổi C→T trên promoter gen MMP-9 của các bệnh nhân UTĐTT tại vị trí -
1562. Vị trí biến đổi này đã được một số nghiên cứu trên thế giới công bố như Peng và cs đã nghiên cứu, biến đối C-1562T là một đa hình trong vùng promoter
gen MMP-9 có vai trị nhất định đóng góp vào sự nhạy cảm di truyền của bệnh
ung thư dù có nghiên cứu cho rằng đa hình này không thể là một yếu tố chính gây nên nguy cơ của hầu hết các loại ung thư [31]. Đa hình này đã được phát hiện ở khá nhiều bệnh ung thư ở người như: ung thư vú [35], ung thư phổi [20], ung thu đại trực tràng [12], ung thu vòm mũi họng [1]…Với mỗi loại ung thư, ảnh hưởng của đa hình C-1562T là khác biệt nhưng nhìn chung, nó đều ảnh hưởng xấu đến quá trình điều trị và tiến triển bệnh của bệnh nhân.
Nhân dịng và giải trình tự
Với kết quả giải trình tự trực tiếp kết hợp với kết quả phân tích PCR- RFLP, chúng tơi lựa chọn ngẫu nhiên một mẫu có hiện tượng dị hợp tử để tiến hành nhân dịng và giải trình tự để khẳng định một lần nữa kết quả thu được từ phương pháp phân tích PCR-RFLP.
Biến nạp
Hình 9: Hình ảnh khuẩn lạc sau khi plasmid được biến nạp vào E. Coli DH5α
Sau khi tế bào khả biến được biến nạp và cấy trải trên đĩa thạch LB đặc có bổ sung thêm Ampicllin để qua đêm ở tủ ấm 37⁰C, thì những khuẩn lạc nào mọc trên đĩa thạch sẽ được kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu MP9 (Hình 9). Nếu khi điện di kiểm tra sản phẩm PCR cho kích thước đúng bằng kích thước của đoạn gen 596bp được chèn vào thì chúng tơi tiếp tục sử dụng phương pháp RFLP để khẳng định mẫu đã chèn là các mẫu có chứa đột biến bằng cách sử
dụng enzyme SphI. Sản phẩm PCR và sản phẩm cắt đều được điện di trên gel
agarose 1,7%, nhuộm EtBr và được quan sát dưới tia UV. Từ kết quả thu được, chúng tôi nhận thấy rằng:
+ Sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc khi điện di thu được băng có kích thước đúng bằng kích thước của đoạn gen được biến nạp là vào khoảng 596 bp.
+ Sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc sau khi được cắt bằng enzyme
SphI thì trên bản điện di thu được kết quả: Xuất hiện hai băng có kích thước
khoảng 358bp và 238bp đối với một khuẩn lạc, và xuất hiện một băng đối với một khuẩn lạc khác. Như vậy, chúng tôi đã thu nhận được một khuẩn lạc chứa biến đổi và một khuẩn lạc không chứa biến đổi.
Tinh sạch plasmid tái tổ hợp
Sau khi đã khẳng định được trong tế bào E.coli DH5α có chứa đoạn gen
sung Ampicillin qua đêm, từ 12-16 tiếng ở 37⁰C. Để tách plasmid chúng tôi sử dụng bộ kit QIA prep Mniprep Kit, sản phẩm thu được tiến hành điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, nhuộm EtBr và quan sát dưới tia UV bước sóng 245nm (Hình 10).
Hình 10: Hình ảnh điện di ADN plasmid được tách từ E.Coli DH5α
Giếng 1: Thang chuẩn ADN 1kb
Giếng 2: Plasmid được chèn đoạn gen khơng có biến đổi Giếng 3: Plasmid được chèn đoạn gen có biển đổi
Plasmid được điện di kiểm tra và đo nồng độ bằng máy đo Nano Drop để kiểm tra độ tinh sạch.
Qua hình ảnh điện di thấy các băng plasmid tương đối sáng, gọn chứng tỏ lượng ADN trong mẫu khá cao và sạch, đủ điều kiện để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Để khẳng định chắc chắn plasmid đã mang đoạn chèn có kích thước khoảng 596bp mong muốn. Tiến hành PCR với cặp mồi đặc hiệu MP9 và cặp mồi pJet1.2 với khuôn là plasmid. Điện di sản phẩm trên gel Agarose 1,7%, nhuộm EtBr, soi dưới tia UV và chụp ảnh (Hình 11).
Hình 11: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ plasmid và sản phẩm cắt bằng enzyme giới hạn
Giếng 1: Thang chuẩn ADN 100bp
Giếng 2,5: Sản phẩm PCR với cặp mồi pJet1.2 Giếng 3,6: Sản phẩm PCR với cặp mồi MP9
Giếng 4, 7: Sản phẩm cắt bằng enzyme giới hạn từ sản phẩm PCR với cặp mồi MP9
Các băng lên rõ nét. Với sản phẩm PCR từ cặp mồi pJet1.2 băng có kích thước lý thuyết khoảng 716bp, sản phẩm PCR từ cặp mồi MP9 có kích thước lý thuyết khoảng 596bp. Khi tiến hành dùng enzyme giới hạn cắt sản phẩm PCR được nhân lên từ cặp mồi MP9 thì khuẩn lạc có plasmid mang đoạn chèn chứa biến đổi bị cắt hồn tồn và tạo thành hai băng có kích thước lý thuyết khoảng 358bp và 238bp (Hình 11 giếng 7). Cịn khuẩn lạc có plasmid mang đoạn chèn khơng chứa biến đổi thì vẫn chỉ có một băng có kích thước lý thuyết khoảng 596bp (Hình 11 giếng 4).
Kết quả giải trình tự plasmid mang đoạn gen chứa đột biến
Với plasmid chứa đoạn promoter gen MMP-9, chúng tơi đã giải trình tự 2