2.3.1.3. Xử lý mẫu
Dơi bị mắc vào bẫy và lưới được gỡ cẩn thận, mỗi cá thể được cho vào một
túi vải. Sau đó, chúng được định loại sơ bộ, gắn nhãn, kiểm tra cân nặng, đo các chỉ số hình thái ngồi và chụp ảnh. Việc định loại sơ bộ được thực hiện theo một số tài liệu được sử dụng phổ biến trong khu vực và trên thế giới [Bates và Harrison, 1997; Csorba và cộng sự , 2003; Francis, 2008; Kruskop, 2013]. Một số cá thể đực trưởng
thành được giữ lại làm mẫu nghiên cứu, lưu giữ ở Bảo tàng Sinh vật thuộc Đại học
Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội và Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật để phục vụ cho những nghiên cứu sau này. Những cá thể khác được thả sau khi
định loại sơ bộ, ghi nhận những thông tin cơ bản và ghi tiếng kêu siêu âm. Đánh giá độ tuổi của mẫu được thực hiện theo [Brunet-Rossinni và Wilkinson, 2009], xác định
giới tính và trạng thái sinh sản được thực hiện theo [Racey, 2009].
Đối với những cá thể được giữ lại làm mẫu, sử dụng chloroform để gây mê
[Simmons và Voss, 2009; Sikes và cộng sự, 2011]. Những mẫu lưu giữ được xử lý và bảo quản dưới dạng mẫu khô (da và sọ) hoặc mẫu ngâm [Kunz, 2009].
2.3.2. Ghi tiếng kêu siêu âm
Tiếng kêu siêu âm của dơi được ghi ở 3 trạng thái: cầm trên tay, bay trong màn bay (cao 2m x rộng 4m x dài 4m) và trong trạng thái đậu cố định trên vách màn. Tiếng
kêu siêu âm được ghi bởi 4 loại thiết bị khác nhau, tùy từng đợt khảo sát:
- Hệ thống PCTape được sử dụng để ghi tiếng kêu siêu âm với chế độ ghi ở mức tối đa 240kHz. Phần mềm Batman được sử dụng để xác định chất lượng tiếng kêu siêu âm của dơi trước khi ghi. Hệ thống PCTape và phần mềm Batman được sản xuất bởi Trườ ng Đa ̣i ho ̣c Tổng hơ ̣p Tuebingen, CHLB Đức.
- Máy dò siêu âm Pettersson D- 240 (Pettersson Elecktronik, Thụy
Điển) (hình 2.4) kết nối với máy ghi âm
(TCD-D100, SONY, Tokyo, Japan) sử dụng hệ thống mở rộng thời gian (x10). Tần số đo được bằng 1/10 tần số thực
tế và thời gian hiển thị bằng 10 lần thời gian thực, ghi âm thanh dưới dạng file “*.WAV”.
- Máy ghi siêu âm Echometer EM3 (Wildlife Acoustics, CHLB Đức) (hình 2.5). EM3 có thể ghi được tiếng kêu có tần số đến 128 kHz và 192 kHz.
File âm thanh được ghi trực tiếp vào thẻ
SD.
Hình 2.4. Máy dị siêu âm Pettersson D-240 [www.batsound.com]
Hình 2.5. Máy ghi siêu âm Echometer EM3 [www.wildlifeacoustics.com] [www.wildlifeacoustics.com]
- Máy ghi siêu âm Song Meter SM2BAT (Wildlife Acoustics, CHLB Đức) (hình 2.6). SM2BAT EM3 có thể ghi
được tiếng kêu có tần số đến
128 kHz và 192 kHz. File âm
thanh được ghi trực tiếp vào thẻ
SD.
Các file âm thanh được ghi
chú riêng cho mỗi cá thể.
2.3.3. Đo các chỉ số hình thái ngồi, sọ và răng
Các số đo sử dụng trong định loại các loài dơi lá mũi được thực hiện theo một số tài liệu hiện đang được sử dụng phổ biến trong khu vực và trên thế giới [Bates và Harrison, 1997; Csorba và cộng sự, 2003; Dietz và von Helversen, 2004; Francis, 2008; Soisook và cộng sự, 2008].
Các chỉ số hình thái ngồi (hình 2.7) sử dụng thước kẹp cầm tay với độ chính xác
đến 0,1mm:
Hình 2.7. Cách đo một số chỉ số hình thái ngồi của dơi [Soisook và cộng sự, 2008]
Hình 2.6. Máy ghi siêu âm SM2BAT [www.wildlifeacoustics.com] [www.wildlifeacoustics.com]
- HSW: Rộng lá mũi trước (đo chỗ rộng nhất). - FA: Dài cẳng tay.
- EH: Cao tai (từ gốc cạnh trước đến đỉnh loa tai, khơng kể chóp lơng).
- HF: Dài bàn chân sau (từ đầu gót chân đến đầu ngón dài nhất, khơng kể chóp lơng hoặc vuốt).
- TIB: Dài xương chày (từ đầu gối đến mắt cá chân).
- T: Dài đuôi (từ lỗ hậu mơn đến chóp đi, khơng kể chóp lơng).
Ngồi ra, một số chỉ số khác như dài đầu – thân và cân nặng cũng được đo
nhưng chỉ được dùng để tham khảo mà không sử dụng trong định loại do các dẫn liệu đó thường thay đổi phụ thuộc nhiều yếu tố như cách thức thực hiện, trạng thái của cá
thể, … [Christian Dietz và von Helversen, 2004].
Các chỉ số kích thước sọ và răng (hình 2.8), sử dụng thước kẹp cầm tay với độ chính
xác đến 0,01mm:
- SL: Dài sọ (từ điểm xa nhất phía sau đến cạnh trước của răng nanh hàm trên). - CCL: Dài nền sọ (từ mép sau lồi cầu chẩm đến cạnh trước của răng nanh hàm trên). - MW: Rộng mấu thái dương (khoảng cách lớn nhất ngang qua vùng thái dương). - ZB: Rộng gò má (bề rộng lớn nhất của sọ ngang qua cung gị má, khơng kể điểm này
nằm ở đâu trên cung gò má).
- IOW: Rộng eo gian ổ mắt (bề rộng chỗ hẹp nhất ngang qua vùng gian ổ mắt).
- ALSW: Rộng các nốt phồng bên (khoảng cách lớn nhất ngang qua hai nốt phồng bên).
- AMSW: Rộng các nốt phồng giữa (khoảng cách lớn nhất ngang qua hai nốt phồng giữa).
- ML: Dài xương hàm dưới (đo từ gờ phía sau nhất đến gờ phía trước của xương hàm
dưới, sát chân răng cửa).
- C-M3: Dài dãy răng hàm trên (từ phía trước răng nanh hàm trên đến phía sau của
đỉnh răng hàm trên cuối cùng).
- C-M3: Dài dãy răng hàm dưới (từ phía trước răng nanh hàm dưới đến phía sau của
đỉnh răng hàm dưới cuối cùng).
- C1-C1: Khoảng cách giữa hai cạnh ngoài răng nanh hàm trên (chiều rộng ngang qua mép ngoài của răng nanh hàm trên).
- M3-M3: Khoảng cách giữa hai cạnh ngoài răng hàm trên thứ ba (chiều rộng ngang qua mép ngồi của răng hàm trên cuối cùng).
Hình 2.8. Cách đo một số chỉ số sọ và răng của dơi lá mũi Rhinolophus [Csorba và cộng sự, 2003] [Csorba và cộng sự, 2003]
2.3.4. Tách chiết DNA, nhân dịng và đọc trình tự gene
Mẫu để tách chiết DNA lấy từ mô cơ ngực của vật mẫu. Mô sau khi cắt ra
được bảo quản trong cồn 95%. Tổng số 21 mẫu đã được tách chiết và phân tích DNA
(phụ lục 2).
DNA tổng số được tách chiết theo phương pháp của Sambrook [Sambrook và Russell, 2001]. Sản phẩm DNA sau khi tách chiết được điện di trên gel agarose và nhuộm với FloroSafe, quan sát dưới đèn tia cực tím để kiểm tra.
Việc tách chiết DNA, nhân dịng gene bằng phản ứng PCR được thực hiện tại phịng thí nghiệm Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên,
Đại học Quốc gia Hà Nội.
Gene ty thể Cytochrome c Oxidase subunit I (COI) được sử dụng trong phân tích di truyền phân tử của các loài thuộc họ Dơi lá mũi ở Việt Nam. Đây là gene được sử dụng rộng rãi trong định loại bằng di truyền phân tử do có tốc độ tiến hóa nhanh và thích hợp với việc dùng để phân biệt giữa các taxon có quan hệ gần gũi [Hebert và cộng sự, 2003]. Ngồi ra, các trình tự của gene COI của các taxon liên quan có sẵn
trong cơ sở dữ liệu của GenBank, dễ dàng truy cập sử dụng và khai thác cho phân
tích, nghiên cứu.
Gene COI được nhân dịng với mồi chung đã được công bố (Universal primers VF1d: 5’–TTCTCAACCAACAARGAYATYGG-3’ và VR1d :5’– TAGACTTCTGGGTGGCCRAARAAYCA-3’ [Ivanova và cộng sự, 2006; deWaard và cộng sự, 2006]. Đoạn gene được nhân dài khoảng 700 bp.
Các sản phẩm PCR được tinh sạch bằng MEGAquick-spinTMTotal Fragment DNA Purification Kit (iNtRON). Sản phẩm sau khi tinh sạch được gửi cho công ty 1st Base Company (Singapore) để đọc trình tự. Việc đọc trình tự được thực hiện bằng
2.4. ĐỊNH LOẠI VÀ PHÂN TÍCH SỐ LIỆU
2.4.1. Định loại bằng hình thái
Tất cả các mẫu vật được lưu giữ, kết hợp với ảnh chụp tương ứng, được định loại theo những tài liệu đã được công bố về phân loại dơi nói chung và dơi lá mũi nói riêng trong khu vực và trên thế giới [Corbet và Hill, 1992; Bates và Harrison, 1997; Csorba và cộng sự, 2003; Borissenko và Kruskop, 2003; Simmons, 2005; Francis, 2008; Vu Dinh Thong, 2011; Kruskop, 2013]. Tên tiếng Việt của các loài được sử dụng theo các tài liệu tiếng Việt hiện đang được sử dụng phổ biến [Đặng Huy Huỳnh và cộng sự, 1994, 2007; Lê Vũ Khôi, 2000, 2001; Đặng Ngọc Cần và cộng sự, 2008].
2.4.2. Phân tích thống kê
Những khác biệt về hình thái, đặc biệt là các chỉ số kích thước ngồi và kích
thước sọ và răng giữa các taxon được xác định bởi phân tích đa biến trong Phân tích
Thành phần chính (Principle Components Analysis – PCA). Phương pháp này được thiết kế để quy số biến cần được quan tâm đến một số lượng nhỏ hơn tổ hợp tuyến tính của các biến ban đầu (được gọi là các thành phần chính). Các biến (các số đo
hình thái và sọ và răng) được quy về các thành phần chính và được tính tốn từ các ma trận tương quan. Các chỉ số hình thái và các chỉ số kích thước sọ và răng đã được
logarit hóa để đảm bảo các số liệu đã được chuẩn hóa [Barlow và cộng sự, 1997] trước khi đưa vào phân tích thành phần chính. Sử dụng kiểm định T-test để đánh giá
mức độ khác biệt của từng đặc điểm giữa các cặp taxon được so sánh [Barlow và cộng sự, 1997].
Ngoài ra, phương pháp phân tích thống kê cũng được sử dụng trong đánh giá tương quan giữa tần số tiếng kêu siêu âm với một số chỉ số hình thái ngồi như cao
tai, dài cẳng tay. Phân tích thành phần chính và phân tích tương quan được thực hiện trên phần mềm PAST v3.14 (Palaeontological Statistics) [Hammer và cộng sự, 2001].
2.4.3. Phân tích tiếng kêu siêu âm
Các files tiếng kêu siêu âm đã ghi được chuyển vào máy tính. Những file được ghi bởi Hệ thống PCTape, Echometer EM3, và Song Meter SM2BAT được phân tích bằng phần mềm Avisoft SASLab Pro (Avisoft Bioacoustics). Những files được ghi bởi máy Peterson D240 được phân tích bởi phần mềm Wavesurfer (KTH Royal Institute of Technology, Sweden) [http://www.speech.kth.se/wavesurfer/]. Trong các phân tích này, sử dụng đồ họa ảnh phổ để xác định tần số ổn định (CF: constant
frequency) ở mức năng lượng cực đại (Frequency of maximum energy (FMAXE)
kHz). Tần số ổn định CF được sử dụng để định loại cũng như phân biệt các loài dơi lá mũi khác nhau. Trong tiếng kêu của mỗi cá thể, chọn đoạn âm thanh liên tục trong 5 giây được thể hiện trên ảnh phổ màu. Trong nghiên cứu này, chỉ sử dụng tần số ổn
định để phục vụ cho việc định loại và phân biệt các loài. Những đặc điểm khác của
tiếng kêu siêu âm như tần số khởi đầu, tần số kết thúc, độ dài tiếng kêu, khoảng cách giữa các tiếng kêu, … khơng được phân tích trong nghiên cứu này. Những đặc điểm này sẽ được phân tích trong các nghiên cứu tiếp theo.
Tín hiệu tiếng kêu siêu âm ghi ở các trạng thái cầm tay, bay trong màn bay,
đậu trên vách màn đã được kiểm tra, đối chiếu. Kết quả phân tích cho thấy ở các lồi dơi lá mũi được nghiên cứu khơng có khác biệt về tần số tiếng kêu siêu âm khi ghi ở
các trạng thái khác nhau. Do đó phần kết quả phân tích chỉ trình bày kết quả xác định tần số tiếng kêu siêu âm nói chung mà khơng phân biệt tần số tiếng kêu siêu âm theo trạng thái nào.
2.4.4. Phân tích di truyền
Các trình tự gene thu được được kiểm chứng với dữ liệu từ GenBank bằng
công cụ BLAST [Altschul và cộng sự, 1997], sau đó tinh chỉnh bằng phần mềm Bioedit version 7.2.5 [Hall, 1999]. Các trình tự gene COI trong nghiên cứu này cùng với 67 trình tự gene tham khảo từ Genbank [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/], (phụ lục 2) sử dụng cho phân tích được
được sắp xếp bằng công cụ ClustalW trong MEGA 6 [Tamura và cộng sự, 2013]. Đoạn gene sử dụng để phân tích di truyền có độ dài 642 bp.
Với các trình tự gene đã được sắp xếp, áp dụng phương pháp Maximum Likelihood (phương pháp Hợp lý tối đa) trong phần mềm MEGA 6 [Tamura và cộng sự, 2013] để xây dựng cây quan hệ di truyền. Phương pháp này được xây dựng trên nguyên tắc đánh giá các giả thuyết về tiến hóa dưới dạng tính tốn xác suất để một mơ hình dự kiến có thể thể hiện tốt nhất dữ liệu di truyền hiện có. Một giả thuyết tiến hóa có xác suất thể hiện trạng thái hiện tại cao sẽ thích hợp hơn so với một giả thuyết có xác suất thể hiện trạng thái hiện tại thấp hơn [Swofford, 1996]. Ngoài ra, phương pháp Maximum Likelihood thường được sử dụng do thường đưa ra những kết quả ước lượng có phương sai thấp hơn [Swofford, 1996]. Phân tích Maximum Likelihood
về phát sinh lồi sẽ đánh giá xác suất để mơ hình tiến hóa được lựa chọn tạo ra các trình tự như thực tế (xác suất của dữ liệu theo mơ hình); tiến hành phân tích chủng loại phát sinh để sau đó chọn ra những cây quan hệ di truyền có tính hợp lý cao nhất [Swofford, 1996].
Sau phân tích, phần mềm chạy 1000 vịng lặp ngẫu nhiên (Bootstrap 1000) để
đánh giá độ tin cậy của các nhánh trong cây quan hệ di truyền.
Khoảng cách di truyền giữa các taxon được tính trên mơ hình Kimura – 2 parameter [Kimura, 1980], sử dụng phần mềm MEGA6 [Tamura và cộng sự, 2013].
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. TÍNH ĐA DẠNG CỦA HỌ DƠI LÁ MŨI Ở VIỆT NAM
3.1.1. Tính đa dạng loài của họ Dơi lá mũi ở Việt Nam
Kết quả nghiên cứu đã ghi nhận được ở Việt Nam có 20 lồi dơi lá mũi thuộc họ Rhinolophidae; trong đó có 7 dạng lồi khác biệt so với những mô tả đã công bố trước đây ở Việt Nam (bảng 3.1).
Bảng 3.1. Các loài và dạng loài dơi lá mũi Rhinolophus được ghi nhận ở Việt Nam qua nghiên cứu này và trước đây
STT
Tên loài Số mẫu
sử dụng trong nghiên cứu này
Nguồn thơng tin Tình trạng bảo tồn
Tên Việt Nam Tên khoa học
Nghiên cứu này Các nghiên cứu trước SĐVN 2007 IUCN Red List 2017-1 Nhóm lồi "megaphyllus“
1. Dơi lá đi Rhinolophus affinis
s.s.
178 x 8, 10, 11, 13, 14, 15
R. cf. affinis 1 21 x
R. cf. affinis 2 24 x
2. Dơi lá sa đen R. chaseni 6 x 11, 13
3. Dơi lá mã lai R. malayanus s.s. 71 x 10, 11, 13
R. cf. malayanus 10 x
4. Dơi lá mũi nam R. stheno 21 x 10, 11, 13
5. Dơi lá mũi bắc R. microglobosus 92 x 8, 10, 11,
13 Nhóm lồi "rouxii“
6. Dơi lá trung
hoa
R. sinicus 20 x 10, 11, 13
7. Dơi lá tô ma R. thomasi s.s. 86 x 10, 11, 13 VU
(B2a)
R. cf. thomasi 24 x
Nhóm lồi "pusillus“
8. Dơi lá nâu R. subbadius 6 x 1, 13, 16
9. Dơi lá mũi nhỏ R. pusillus 144 10, 11, 13,
15 10. Dơi lá le pit R. lepidus 46 x 10, 11, 13
STT
Tên loài Số mẫu
sử dụng trong nghiên cứu này
Nguồn thơng tin Tình trạng bảo tồn
Tên Việt Nam Tên khoa học
Nghiên cứu này Các nghiên cứu trước SĐVN 2007 IUCN Red List 2017-1 12. Dơi lá mũi nhọn R. acuminatus 48 x 11, 13 Nhóm lồi "euryotis“
13. Dơi lá sa men R. shameli 40 x 11, 13, 15 Nhóm lồi "pearsonii“
14. Dơi lá pec xôn R. pearsonii 138 x 10, 11, 13, 15
15. Dơi lá đôp xôn R. yunnanensis 27 x 12 Nhóm lồi "philippinensis“
16. Dơi lá thái lan R. siamensis 44 x 11, 13 17. Dơi lá tai dài R. macrotis s.s. 16 x 1, 17
R. cf. macrotis 3 x 17
18. Dơi lá quạt R. paradoxolophus
s.s. 22 x 2, 9, 10, 11, 13 VU (D1) R. cf. paradoxolophus 1 x
19. Dơi lá ma san R. cf. marshalli 1 38 x 4, 6, 10, 11, 13
R. cf. marshalli 2 2 x
Nhóm lồi "trifoliatus“
20. Dơi lá lớn R. luctus 5 x 5, 7, 10, 11, 13
Ghi chú: x : kết quả của nghiên cứu này; 1 – [Osgood, 1932]; 2 – [Bourret, 1951]; 3 – [Topal, 1974]; 4 – [Hill và Topal, 1990]; 5 – [Topal và Csorba, 1992]; 6 – [Csorba và Topal, 1994]; 7 – [Đặng Huy Huỳnh và cộng sự, 1994]; 8 – [Csorba và Jenkins, 1998]; 9 – [Eger và Theberge, 1999]; 10 – [Hendrichsen và cộng sự, 2001]; 11 – [Đặng Ngọc Cần và cộng sự, 2008]; 12 – [Furey và cộng sự, 2010]; 13 – [Kruskop, 2013]; 14 – [Ith và cộng sự, 2015]; 15 – [Nguyen Truong Son và cộng sự, 2016]; 16 – [Corbet và Hill, 1992]; 17 – [Vuong Tan Tu và cộng sự, 2016].
Trong tài liệu "Bats of Vietnam – Checklist and an identification manual", Kruskop
(2013) đã công bố dẫn liệu cập nhật nhất về các loài dơi ở Việt Nam; trong đó, có 19 lồi dơi
lá mũi, bao gồm: R. affinis, R. chaseni, R. malayanus, R. stheno, R. microglobosus, R. sinicus,
R. thomasi, R. subbadius, R. pusillus, R. cf. lepidus, R. acuminatus, R. pearsonii, R. yunnanensis, R. shameli, R. macrotis, R. siamensis, R. luctus, R. paradoxolophus, R. marshalli
[Kruskop, 2013]. Trong số này có 16 lồi được ghi nhận căn cứ vào mẫu vật nghiên cứu, 2 loài tham khảo từ các cơng bố trước đó (R. yunanensis, R. siamensis), 1 lồi (R. subbadius)
nhưng khơng có thơng tin về mẫu vật nghiên cứu và cũng khơng có nguồn thơng tin tham khảo. Trong đó có bàn luận về kết quả của một số nghiên cứu trước về loài R. subbadius nhưng
nhận định những ghi nhận trước đây là do định loại nhầm [Kruskop, 2013] và khơng có thơng tin thuyết phục về sự tồn tại của loài này ở Việt Nam.
So với công bố của Kruskop (2013), kết quả nghiên cứu này đã bổ sung thêm một loài
dơi lá mũi cho Việt Nam – lồi Dơi lá ơ gut R. osgoodi. Bên cạnh đó, với các vật mẫu thu