Chương 1 TỔNG QUAN VỀ NHỮNG VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
2.4. ĐỊNH LOẠI VÀ PHÂN TÍCH SỐ LIỆU
2.4.1. Định loại bằng hình thái
Tất cả các mẫu vật được lưu giữ, kết hợp với ảnh chụp tương ứng, được định loại theo những tài liệu đã được cơng bố về phân loại dơi nói chung và dơi lá mũi nói riêng trong khu vực và trên thế giới [Corbet và Hill, 1992; Bates và Harrison, 1997; Csorba và cộng sự, 2003; Borissenko và Kruskop, 2003; Simmons, 2005; Francis, 2008; Vu Dinh Thong, 2011; Kruskop, 2013]. Tên tiếng Việt của các loài được sử dụng theo các tài liệu tiếng Việt hiện đang được sử dụng phổ biến [Đặng Huy Huỳnh và cộng sự, 1994, 2007; Lê Vũ Khôi, 2000, 2001; Đặng Ngọc Cần và cộng sự, 2008].
2.4.2. Phân tích thống kê
Những khác biệt về hình thái, đặc biệt là các chỉ số kích thước ngồi và kích
thước sọ và răng giữa các taxon được xác định bởi phân tích đa biến trong Phân tích
Thành phần chính (Principle Components Analysis – PCA). Phương pháp này được thiết kế để quy số biến cần được quan tâm đến một số lượng nhỏ hơn tổ hợp tuyến tính của các biến ban đầu (được gọi là các thành phần chính). Các biến (các số đo
hình thái và sọ và răng) được quy về các thành phần chính và được tính tốn từ các ma trận tương quan. Các chỉ số hình thái và các chỉ số kích thước sọ và răng đã được
logarit hóa để đảm bảo các số liệu đã được chuẩn hóa [Barlow và cộng sự, 1997] trước khi đưa vào phân tích thành phần chính. Sử dụng kiểm định T-test để đánh giá
mức độ khác biệt của từng đặc điểm giữa các cặp taxon được so sánh [Barlow và cộng sự, 1997].
Ngồi ra, phương pháp phân tích thống kê cũng được sử dụng trong đánh giá tương quan giữa tần số tiếng kêu siêu âm với một số chỉ số hình thái ngồi như cao
tai, dài cẳng tay. Phân tích thành phần chính và phân tích tương quan được thực hiện trên phần mềm PAST v3.14 (Palaeontological Statistics) [Hammer và cộng sự, 2001].
2.4.3. Phân tích tiếng kêu siêu âm
Các files tiếng kêu siêu âm đã ghi được chuyển vào máy tính. Những file được ghi bởi Hệ thống PCTape, Echometer EM3, và Song Meter SM2BAT được phân tích bằng phần mềm Avisoft SASLab Pro (Avisoft Bioacoustics). Những files được ghi bởi máy Peterson D240 được phân tích bởi phần mềm Wavesurfer (KTH Royal Institute of Technology, Sweden) [http://www.speech.kth.se/wavesurfer/]. Trong các phân tích này, sử dụng đồ họa ảnh phổ để xác định tần số ổn định (CF: constant
frequency) ở mức năng lượng cực đại (Frequency of maximum energy (FMAXE)
kHz). Tần số ổn định CF được sử dụng để định loại cũng như phân biệt các loài dơi lá mũi khác nhau. Trong tiếng kêu của mỗi cá thể, chọn đoạn âm thanh liên tục trong 5 giây được thể hiện trên ảnh phổ màu. Trong nghiên cứu này, chỉ sử dụng tần số ổn
định để phục vụ cho việc định loại và phân biệt các loài. Những đặc điểm khác của
tiếng kêu siêu âm như tần số khởi đầu, tần số kết thúc, độ dài tiếng kêu, khoảng cách giữa các tiếng kêu, … không được phân tích trong nghiên cứu này. Những đặc điểm này sẽ được phân tích trong các nghiên cứu tiếp theo.
Tín hiệu tiếng kêu siêu âm ghi ở các trạng thái cầm tay, bay trong màn bay,
đậu trên vách màn đã được kiểm tra, đối chiếu. Kết quả phân tích cho thấy ở các lồi dơi lá mũi được nghiên cứu khơng có khác biệt về tần số tiếng kêu siêu âm khi ghi ở
các trạng thái khác nhau. Do đó phần kết quả phân tích chỉ trình bày kết quả xác định tần số tiếng kêu siêu âm nói chung mà khơng phân biệt tần số tiếng kêu siêu âm theo trạng thái nào.
2.4.4. Phân tích di truyền
Các trình tự gene thu được được kiểm chứng với dữ liệu từ GenBank bằng
công cụ BLAST [Altschul và cộng sự, 1997], sau đó tinh chỉnh bằng phần mềm Bioedit version 7.2.5 [Hall, 1999]. Các trình tự gene COI trong nghiên cứu này cùng với 67 trình tự gene tham khảo từ Genbank [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/], (phụ lục 2) sử dụng cho phân tích được
được sắp xếp bằng công cụ ClustalW trong MEGA 6 [Tamura và cộng sự, 2013]. Đoạn gene sử dụng để phân tích di truyền có độ dài 642 bp.
Với các trình tự gene đã được sắp xếp, áp dụng phương pháp Maximum Likelihood (phương pháp Hợp lý tối đa) trong phần mềm MEGA 6 [Tamura và cộng sự, 2013] để xây dựng cây quan hệ di truyền. Phương pháp này được xây dựng trên nguyên tắc đánh giá các giả thuyết về tiến hóa dưới dạng tính tốn xác suất để một mơ hình dự kiến có thể thể hiện tốt nhất dữ liệu di truyền hiện có. Một giả thuyết tiến hóa có xác suất thể hiện trạng thái hiện tại cao sẽ thích hợp hơn so với một giả thuyết có xác suất thể hiện trạng thái hiện tại thấp hơn [Swofford, 1996]. Ngoài ra, phương pháp Maximum Likelihood thường được sử dụng do thường đưa ra những kết quả ước lượng có phương sai thấp hơn [Swofford, 1996]. Phân tích Maximum Likelihood
về phát sinh lồi sẽ đánh giá xác suất để mơ hình tiến hóa được lựa chọn tạo ra các trình tự như thực tế (xác suất của dữ liệu theo mơ hình); tiến hành phân tích chủng loại phát sinh để sau đó chọn ra những cây quan hệ di truyền có tính hợp lý cao nhất [Swofford, 1996].
Sau phân tích, phần mềm chạy 1000 vòng lặp ngẫu nhiên (Bootstrap 1000) để
đánh giá độ tin cậy của các nhánh trong cây quan hệ di truyền.
Khoảng cách di truyền giữa các taxon được tính trên mơ hình Kimura – 2 parameter [Kimura, 1980], sử dụng phần mềm MEGA6 [Tamura và cộng sự, 2013].