Đường chuẩn GABA xây dựng bằng phương pháp HPLC

2.4.2. Phương pháp hoạt hóa chủng giống

Các chủng vi sinh vật lưu giữ tại Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Việt Nam (VTCC) được hoạt hóa và tinh sạch trên mơi trường ni cấy MRS. Sau đó, quan sát hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào các chủng vi sinh vật.

2.4.3. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp GABA cao

Các chủng Lactobacillus được hoạt hóa trên mơi trường MRS thạch sau 48

giờ. Sau đó sẽ được cấy chuyển sang ống nghiệm thủy tinh chứa môi trường MRSS bổ sung 1% glutamate tại 37oC, 48 giờ. Dịch nuôi cấy được đem đi ly tâm 15000 rpm/15phút/4oC loại bỏ cặn thu dịch phía trên. Dịch thu được định tính bằng phương pháp sắc ký bản mỏng-TLC.

2.4.4. Phương pháp phân loại

2.4.4.1. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn axit lactic

Quan sát hình thái khuẩn lạc: Các chủng vi khuẩn axit lactic thuần khiết

được cấy ria ba pha trên môi trường thạch MRS trong 72 giờ ở 37oC. Tiến hành quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc theo các tiêu chí như: màu sắc, độ bóng, mức độ trơn nhẵn, trạng thái bề mặt.

Hình thái tế bào : Các chủng được tinh sạch cấy ria ba pha trên môi trường đĩa

thạch MRS trong 48 giờ ở 37oC. Tiến hành nhuộm Gram để quan sát hình thái tế bào.

Quy trình nhuộm Gram như sau:

Nguyên tắc: Nhuộm Gram (phản ứng Gram) có vai trò đặc biệt trong việc

tím kết tinh và iot nên có sự tạo thành phức chất tím kết tinh iot bên trong tế bào. Khi vi khuẩn Gram âm bị tẩy cồn, lipit của lớp màng ngồi bị hồ tan làm tăng tính thấm của màng dẫn đến sự rửa trôi phức chất tím – iot và làm cho vi khuẩn mất màu. Khi nhuộm bổ sung chúng sẽ bắt màu với thuốc đỏ vàng với Safranin hay đỏ tía với Fuchsin. Ở vi khuẩn Gram dương, cồn làm cho các lỗ trong peptidoglycan co lại do đó phức chất tím – iot bị giữ lại bên trong tế bào.

Phương pháp tiến hành:

• Chuẩn bị lam kính sạch, rửa bằng nước cất vơ trùng và làm khơ bằng thổi gió trong box cấy.

• Cố định tế bào vi khuẩn bằng hơi nóng của đèn cồn • Nhỏ dung dịch tím tinh thể trong 1 phút 30 giây

• Rửa nhẹ tiêu bản lại bằng nước cất, sau đó nhuộm với iodine trong vòng 1 phút

• Rửa nhẹ iodine thừa bằng nước, sau đó tẩy màu bằng cồn 96% khoảng 5 giây cho đến khi tiêu bản có màu trong, thời gian phụ thuộc vào độ dày đặc của mẫu

• Rửa tiêu bản bằng cồn ngay lập tức bằng nước, sau khi tẩy cồn. Những vi khuẩn gram âm sẽ khơng nhìn thấy trên tiêu bản

• Nhỏ safranin trong 30-45 giây. Rửa nhẹ tiêu bản và để khơ trong khơng khí hoặc giấy thấm, gió thổi trong box cấy. Các vi khuẩn gram âm có thể nhìn thấy nhau khi nhuộm Safranin, tế bào có màu đỏ hồng.

• Tiến hành quan sát tế bào vi khuẩn sau khi nhuộm gram qua kính hiển vi vật kính 100X. Các đặc điểm của tế bào được mô tả gồm màu sắc sau khi nhuộm để xác định Gram âm nếu tế bào sau khi nhuộm quan sát được đỏ vàng hay đỏ tía hay Gram dương nếu là màu xanh đen hoặc tím, hình dạng, kiểu phân bố, kích thước tế bào, khả năng tạo bào tử.

Chú ý: Bước làm khơ tiêu bản rất quan trọng, vì nếu tiêu bản chưa khơ, khi soi dưới

kính hiển vi ở vật kính dầu, thì các tế bào không sắc nét, khó quan sát được hình ảnh đặc trưng của tế bào.

2.4.4.2. Phân loại vi khuẩn dựa trên phân tích trình tự rDNA

➢ Tách chiết DNA từ vi khuẩn

Thực hiện theo phương pháp của Sakiyama và cộng sự (2009) - Ly tâm 1.5ml dịch nuôi vi khuẩn lấy sinh khối tế bào

- Hoà sinh khối tế bào trong 100 l TE.

- Thêm 0,4 mg lysozyme. Trộn đều, ủ 370C trong 1 giờ. Trộn đều 3 phút - Thêm 100 l SDS 10% (w/v), trộn đều 2-3 phút trộn thật kỹ, ủ 370C/30phút.

- Thêm một thể tích tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol (PCI), trộn đều. Ly tâm 15.000v/p, 15phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống Eppendoft khác.

- Thêm 8 l RNAse 3 mg/ml, trộn đều, ủ ở 370C trong 30 phút - Thêm 12 l proteinase K (5 mg/ml), trộn đều, ủ 15 phút ở 560C

- Thêm một thể tích tương đương PCI, trộn đều. Ly tâm 15.000v/p, 15 phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống Eppendoft khác.

- Thêm 1 thể tích tương chloroform: isoamyl alcohol, trộn đều, ly tâm 15.000v/p, 15 phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống Eppendoft khác.

- Thêm 1/10 V Natri acetat 3M và 1ml Ethanol 100%, đảo trộn. Đặt trong đá 30 phút.

- Ly tâm 15.000v/p trong 15 phút. Bỏ lớp dịch trên. - Rửa tủa bằng ethanol 70%.

- Làm khô DNA bằng máy cơ quay chân khơng. - Hồ tan DNA trong 50-100l nước hoặc TE. - Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di

Đun tan 1% agarose (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agarose: 1g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml dung dịch 1 X TAE. Trộn 2 l dung dịch 6X loading buffer với 5 l mẫu trộn đều, nhỏ vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cưòng độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr (nồng độ 0,5 l/ml) 20 phút vớt ra. Quan sát trên máy soi gel.

• Phản ứng khuếch đại ADN

Thành phần phản ứng

Thành phần Thể tích (l)

10X buffer 10

dNTP 2.0 mM 10

Mồi xuôi (10 pmol/l) 2

Mồi ngược (10 pmol/l) 2

Taq polymerase (5u/l) 2

DNA khuôn (50-100g/l) 1-2 H2O đủ 100 Chu trình nhiệt: 950C 3 phút x 30 chu kỳ 950C 30 giây 560C 15 giây 720C 1 phút 720C 5 phút 400C  Mồi :

Mồi xuôi 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'. Mồi ngược 1525R: 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3' - Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di

Đun tan 1% agarose (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agarose: 1g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml dung dịch 1X TAE. Trộn 2 l dung dịch 6X loading buffer với 5 l mẫu trộn đều, nhỏ vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cưòng độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr (nồng độ 0,5 l/ml) 20 phút vớt ra. Quan sát trên máy soi gel

Tinh sạch sản phẩm PCR

• Sử dụng bộ kit QIAgen theo chỉ dẫn của nhà sản xuất. - Thêm dung dịch PBI vào mẫu theo thể tích 5:1. Trộn đều. - Cho hỗn hợp mẫu vào cột, ly tâm 10.000 v/p trong 1 phút . - Đổ bỏ dịch phía dưới cột.

- Bổ sung 750 l PE buffer lên cột. Ly tâm 10.000 v/p trong 1 phút - Đổ bỏ dịch dưới cột

- Ly tâm tiếp 10.000 v/p trong 1 phút - Chuyển cột sang ống Eppendoft mới

- Thêm 30l nước. Để ở nhiệt độ phòng 5 phút - Ly tâm 10.000 v/p trong 1 phút

- Lấy dịch phía dưới.

• Kiểm tra độ tinh sạch của mẫu:

Mẫu được kiểm tra trên máy quang phổ ở các bước sóng 260 và 280. Tính tỷ lệ tinh sạch : OD 260/OD 280 > 1,7

➢ Phản ứng khuếch đại DNA cho đọc trình tự

- Terminator Ready Reaction Mix (Termix):

Buffer 5X 9l

Bigdye Ready Reaction premix 18l

H2O H2O

- Thành phần phản ứng PCR cho đọc trình tự:

Termix 8l

Mồi (*) 1l

ADN khuôn 1l ( nồng độ ADN là 40-60 g/ml)

H2O 10l

(*) Các loại mồi sử dụng:

27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'. 1525R: 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3'.

780F: 5'-GAATTGATACCCTGGTAG-3.' 350R: 5'-CTGCTGCCTCCCGTAG-3'. 1100F: 5'-GCAACGAGCGCAACCC-3'. 920R: 5'-GTCAATTCCTTTGAGTTT-3'. - Chu trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại gen:

960C 1phút 960C 10giây X 25 chu kỳ 500C 5 giây 600C 4 phút ➢ Tinh sạch sản phẩm PCR cho đọc trình tự

- Chuyển 20l sản phẩm sang ống Eppendoft sạch

- Thêm 5l EDTA 125mM và 60l ethanol 100%. Để khoảng 15 phút ở nhiệt độ phòng.

- Ly tâm 15.000v/p, 15phút

- Bỏ dịch, thêm 60l ethanol 70% để rửa, ly tâm 15.000v/p, 10 phút - Làm khô.

- Thêm 10l HiDi Formamide - Để ở 960C trong 2 phút

- Cho ngay mẫu vào nước đá lạnh

- Chuyển toàn bộ mẫu vào giếng trong khay dùng cho đọc trình tự. - Vận hành máy xác định trình tự gen ABI 3100 Avant

➢ Phân tích trình tự và xây dựng cây phát sinh chủng loại

Trình tự của rDNA 16S được phân tích sử dụng phần mềm CLUSTAL W ver 1.83 của Thompson và cộng sự (1997). Các trình tự tham khảo dùng trong nghiên cứu cây phát sinh chủng loại được lấy từ dữ liệu của DDBJ, EMBL, GenBank. Cây phát sinh được xây dựng theo Kimura (1980), sử dụng phương pháp của Saitou và Nei (1987).

2.4.5. Phương pháp khếch đại gen GAD

GABA được tổng hợp từ sự khử cacbon của L-glutamate bằng GAD. Khi

GAD hoạt động càng mạnh thì GABA tạo ra càng nhiều.Việc đầu tiên là xác định sự có mặt gen GAD trong chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu. Các chủng

Lactobacillus được hoạt hóa trên mơi trường MRS thạch sau 48h. Sau đó được tách

chiết theo phương pháp của Sakiyama và cộng sự. Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel Agarose 1 %. Chu trình nhiệt: ( 90°C – 30s, 60°C – 30s , 72°C – 90s) x 35 chu kì. Và sử dụng cặp mồi với trình tự:

- GAD forward primer 5': -ATGGCAATGTTATACGGTAAACAC-3' - GAD reverse primer 5'- TCAGTGTGTGAATAGGTATTTCTTAGGT-3' Hỗn hợp phản ứng : Master mix 12,5µl Forward primer (10µM) 0,5µl Reverse primer (10µM) 0,5 µl DNA 3 µl H2O 8,5 µl Total 25 µl

- Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di

Đun tan 1% agarose (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agarose: 1g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml dung dịch 1X TAE. Trộn 2 l dung dịch 2X loading buffer với 5 l mẫu trộn đều, nhỏ vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cưòng độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr (nồng độ 0,5 l/ml) 20 phút vớt ra. Quan sát trên máy soi gel

2.4.6. Thử nghiệm khả năng lên men tạo GABA trên lá chè của vi khuẩn lactic

Các chủng Lactobacillus hoạt tính sinh enzyme glutamate decarboxylase

24 giờ. Lá chè được đảo nóng sau đó vị dập rồi được đựng vào các túi zip. Bổ sung 10% thể tích giống ni cấy vào trong các túi chè, trộn đều và hút hết khí bên trong túi ủ ở 37oC sau 1 đến 7 ngày lên men . Mỗi ngày lấy ra 3g chè trong mỗi túi đem đi sấy khơ sau đó cân 1g mỗi mẫu chè đã được sấy khô chiết với 10ml nước để lắc ở 37oC, 2 giờ. Đem dịch chiết được ly tâm 3000g/5 phút loại bỏ cặn thu dịch phía trên (Su YC, 2003). Dịch thu được định tính bằng phương pháp sắc ký bản mỏng-TLC và định lượng bằng phương pháp quang phổ. Các chủng vi khuẩn thích hợp được lựa chọn để thử nghiệm các thí nghiệm tiếp theo.

2.4.7. Lựa chọn điều kiện ni cấy thích hợp cho chủng nghiên cứu

2.4.7.1. Lựa chọn môi trường và thời gian ni cấy thích hợp

Các chủng Lactobacillus có hoạt tính sinh enzyme glutamate decarboxylase được hoạt hóa trong dịch thể MRS trong 48 giờ. Sau đó hút 5% giống vào các môi trường dịch thể M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7, M8 bổ sung 1% glutamate. Nuôi ở 37oC sau 24, 48 và 102 giờ. Xác định mật độ tế bào bằng cách đo OD600 và dịch nuôi cấy được ly tâm 15000rpm/15 phút/4oC loại bỏ cặn thu dịch phía trên. Dịch thu được định tính bằng phương pháp sắc ký bản mỏng-TLC và định lượng bằng phương pháp quang phổ.

2.4.7.2. Lựa chọn nhiệt độ thích hợp

Tương tự như tối ưu môi trường, cấy 5% thể tích giống nuôi cấy trên các nhiệt độ khác nhau từ 20oC đến 55oC trên mơi trường thích hợp. Sau 24 giờ xác định OD600.

2.4.7.3. Lựa chọn pH thích hợp

Các chủng vi khuẩn được nuôi trên các pH khác nhau từ 4, 5, 6, 7, 8 và 9 trên các mơi trường và nhiệt độ thích hợp với 5% giống. Sau 24 giờ xác định OD và pH sau khi ni.

2.4.7.4. Lựa chọn điều kiện cung cấp khí thích hợp

Các chủng vi khuẩn được nuôi với tỷ lệ giống 5% lần lượt vào mơi trường thích hợp ở điều kiện lắc (200 vịng/phút), tĩnh và mơi trường vi hiếu khí (bổ sung 1g NaNO3/ 1 lít vào ống nghiệm nút xốy), ni ở nhiệt độ tối ưu. Sau 24 giờ nuôi cấy xác định mật độ tế bào (đo OD600).

2.4.7.5. Lựa chọn tỷ lệ giống thích hợp

Các chủng vi khuẩn được ni cấy trên mơi trường,nhiệt độ thích hợp với tỷ lệ giống 1, 3, 5, 7 và 10 %. Sau 24 giờ nuôi cấy xác định OD600.

2.4.7.6. Lựa chọn nguồn Nitơ thích hợp

Ni các chủng vi khuẩn theo tỷ lệ giống, nhiệt độ, hàm lượng và nguồn Carbon thích hợp trên mơi trường được thay thế nguồn nitơ bằng các nguồn hữu cơ:

malt extract, yeast extract, meat extract , pepton, trypton và urea; nguồn vô cơ như

amonisunfat, NaNO2, NaNO3, casein, ĐC dương (pepton và cao thịt), ĐC âm (khơng có pepton và cao thịt). Sau 24 giờ nuôi cấy, xác định mật độ tế bào (đo OD600).

2.4.7.7. Lựa chọn nguồn carbon thích hợp

Các chủng vi khuẩn được ni trên nhiệt độ và tỷ lệ giống thích hợp trên các môi trường được thay thế bằng các nguồn carbon khác nhau như glucose (ĐC dương), khơng có glucose (ĐC âm), nguồn Fructose, Galactose, Lactose, Maltose, Mannitol , Saccharose, tinh bột,CMC và skimmilk. Sau 24 giờ xác định mật độ tế bào (OD600).

2.4.7.8. Lựa chọn hàm lượng glutamate thích hợp

Thay đổi hàm lượng glutamate từ 0-5% trong mơi trường thích hợp để ni các chủng vi khuẩn. Xác định mật độ tế bào (đo OD600).

2.4.8. Nghiên cứu điều kiện lên men tạo GABA trên lá chè cao bằng việc sử dụng chủng vi khuẩn lactic

2.4.8.1. Lựa chọn thời gian lên men thích hợp

Các chủng Lactobacillus lựa chọn được cấy vào các bình tam giác chứa mơi trường MT1 bổ sung 1% glutamate ở 37oC, 24 giờ. Lá chè được đảo nóng sau đó vị dập rồi được đựng vào các túi zip. Bổ sung 10% thể tích giống ni cấy vào trong các túi chè, trộn đều và được hút hết khí bên trong túi ủ ở 37oC trong 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ngày lên men . Mỗi ngày lấy ra 3g chè trong mỗi túi đem đi sấy khơ sau đó cân 1g mỗi mẫu chè đã được sấy khô chiết với 10ml nước để lắc ở 37oC, 2 giờ. Đem dịch chiết được ly tâm 3000g/5 phút loại bỏ cặn thu dịch phía trên. Dịch thu được định

tính bằng phương pháp sắc ký bản mỏng-TLC và định lượng bằng phương pháp quang phổ.

2.4.8.2. Lựa chọn tỷ lệ giống cấy thích hợp

Tương tự như tối ưu thời gian lên men, cấy 2, 5, 10, 15, 20% thể tích giống ni cấy vào trong các túi chè, trộn đều và hút hết khí bên trong túi ủ ở 37oC trong 2 ngày lên men . Sau đó lấy ra 3g chè trong mỗi túi đem đi sấy khơ sau đó cân 1g mỗi mẫu chè đã được sấy khô chiết với 10ml nước để lắc ở 37oC, 2 giờ. Đem dịch chiết được ly tâm 3000g/5 phút loại bỏ cặn thu dịch phía trên. Dịch thu được định tính bằng phương pháp sắc ký bản mỏng-TLC và định lượng bằng phương pháp quang phổ.

2.4.8.3. Lựa chọn độ ẩm lên men thích hợp

Các chủng Lactobacillus lựa chọn được cấy vào các bình tam giác chứa môi trường MT1 bổ sung 1% glutamate ở 37oC, 24 giờ. Lá chè được đảo nóng sau đó vị dập rồi được đựng vào các túi zip và bổ sung thêm nước cất để tạo thành 5 gradient độ ẩm khác nhau là 59, 62, 63, 70, 75%. Bổ sung 10% thể tích giống ni cấy vào trong các túi chè, trộn đều và hút hết khí bên trong túi ủ ở 37oC trong 2 ngày lên men . Sau đó lấy ra 3g chè trong mỗi túi đem đi sấy khơ sau đó cân 1g mỗi mẫu chè