(Giếng 1,2,3: Chứng âm ; Giếng 4: B-411 ; Giếng 5: B-439; Giếng 6: Marker 1kb) Kết quả hiện trên bản điện di cho thấy đoạn mồi có khả năng nhân lên đoạn gen có kích thước khoảng 1400bp giống với kích thước nhóm gen đặc hiệu mà nhóm nghiên cứu của Yee-Song Law và cộng sự đã tìm ra. Ngồi ra khi cho phản ứng PCR đoạn mồi với mẫu DNA của vi khuẩn lactic khác thì khơng quan sát được băng DNA trên bản điện di, chứng tỏ rằng 2 chủng B-411 và B-439 nghiên cứu đều có chứa gen GAD.
3.3.2. Xác định GABA trong mẫu chè lên men bằng phương pháp HPLC
GABA chuẩn được phân tích bằng phương pháp HPLC, sau khi chạy sắc kí cho kết quả ở hình 3.7.a. Từ sắc kí đồ thu được cho thấy GABA chuẩn sau khi cho 1 pic duy nhất sau 11 ± 0,8 phút. Tiếp tục chạy sắc kí dịch lên men thô với 2 chủng B-439 và B-411, sắc kí đồ vẫn cho pic giống với pic GABA chuẩn sau 11,867 phút và 11,880 phút thôi cột. ( hình 3.7.b và 3.7.c). Điều đó cho phép chúng tơi khẳng định 1 lần nữa trong dịch lên men đã sinh ra GABA.
a.
b.
c.
Hình 3.7. Sắc kí đồ GABA bằng HPLC. a, GABA chuẩn; b, dịch lên men chủng
3.4. Lựa chọn điều kiện ni cấy thích hợp cho khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn lactic chủng vi khuẩn lactic
3.4.1. Lựa chọn môi trường và thời gian ni cấy thích hợp
Các chủng vi khuẩn VTCC-B-439, VTCC-B-411 được nuôi trong các môi trường dịch thể được ký hiệu từ M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7, M8 bổ sung 1% glutamate vào môi trường ở nhiệt độ 37oC. Sau 24, 48, 72 và 102 giờ nuôi cấy, xác định mật độ tế bào bằng cách đo OD600 và định lượng hàm lượng GABA trong dịch nuôi cấy. Kết quả được thể hiện ở biểu đồ sau:
Bảng 3.3. Lựa chọn môi trường và thời gian nuôi vi khuẩn tạo GABA của 2 chủng VTCC-B-439 và VTCC-B-411
A. Chủng VTCC-B-439
Môi trường
Chủng VTCC-B-439
24 giờ 48 giờ 72 giờ 102 giờ
OD600 GABA (mg/ml) OD600 GABA (mg/ml) OD600 GABA (mg/ml) OD600 GABA (mg/ml) M1 2,376 0,428 2,987 0,5583 3,246 0,523 3,321 0,499 M2 2,729 0,633 3,286 0,8149 3,286 0,703 3,28 0,623 M3 1,416 0,312 2,094 0,323 2,297 0,349 0,886 0,312 M4 1,407 0,232 1,477 0,303 1,564 0,289 1,012 0,2 M5 1,458 0,334 1,881 0,412 1,982 0,387 1,189 0,235 M6 1,585 0,314 1,879 0,328 1,812 0,322 2,043 0,212 M7 1,262 0,413 0,824 0,545 0,801 0,468 0,365 0,321 M8 1,519 0,424 0,689 0,591 0,768 0,521 1,11 0,323
B. Chủng VTCC-B-411
Môi trường
Chủng VTCC-B-411
24 giờ 48 giờ 72 giờ 102 giờ
OD600 GABA (mg/ml) OD600 GABA (mg/ml) OD600 GABA (mg/ml) OD600 GABA (mg/ml) M1 3,285 0,523 3,405 0,6791 3,345 0,592 3,319 0,411 M2 2,831 0,602 3,136 0,8013 3,332 0,699 3,279 0,599 M3 1,373 0,311 0,776 0,311 2,129 0,315 0,889 0,301 M4 1,298 0,241 3,292 0,297 1,256 0,267 1,058 0,225 M5 1,462 0,329 1,946 0,378 2,002 0,336 0,963 0,216 M6 1,686 0,327 1,809 0,397 1,987 0,364 2,011 0,217 M7 1,142 0,439 0,724 0,599 0,977 0,432 0,217 0,304 M8 1,553 0,436 0,535 0,545 0,562 0,537 0,664 0,334
Dựa vào kết quả Bảng 3.3 ta thấy, hai chủng được nuôi trên 8 loại môi trường khác nhau đều có mật độ tế bào và hàm lượng GABA ở các mức độ khác nhau. Khi nuôi chủng trong môi trường M1, M2, khả năng sinh trưởng và hàm lượng GABA của 2 chủng đều cao. Tuy nhiên, các chủng sinh trưởng trên môi trường M1 tốt hơn trên M2, nhưng hàm lượng GABA lại thấp hơn. Vì vậy chúng tơi lựa chọn môi trường M2 là môi trường nuôi cấy để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
3.4.2. Lựa chọn nhiệt độ ni cấy thích hợp
Các chủng được nuôi trong môi trường tối ưu M2 ở các nhiệt độ khác nhau 20oC, 25oC, 30oC, 35oC, 40oC, 45oC, 50oC, 55oC sau 24 giờ xác định mật độ tế bào. Kết quả trên hình 3.8