Theo kết quả hình 3.12, khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn khi nuôi trên các nguồn carbon khác nhau rất khác nhau. Trong đó, các chủng nghiên cứu có xu hướng sinh trưởng tốt ở các nguồn Carbon như Saccharose, Lactose, Glucose (Đc+). Tuy nhiên, khả năng sinh trưởng tốt nhất khi vi khuẩn được ni trên nguồn carbon là Lactose. Vì vậy, chúng tơi chọn Lactose là nguồn Carbon tối ưu cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.4.8. Lựa chọn tỷ lệ Glutamate thích hợp
Các chủng vi khuẩn được ni ở mơi trường dịch thể M2 có tỷ lệ glutamate khác nhau thay đổi từ 0-5% ở 35oC trong vòng 24 giờ. Sau đó, đo OD của các chủng vi khuẩn lactic. Kết quả được thể hiện ở hình 3.13 bên dưới:
Hình 3.13. Mật độ tế bào của các chủng nghiên cứu ni cấy trên mơi trường có tỷ lệ glutamate khác nhau
Dựa vào biểu đồ trên cho thấy, ở các tỷ lệ glutamate từ 0-1%, mật độ tế bào của các chủng xấp xỉ ngang bằng nhau. Mật độ tế bào đạt giá trị cao nhất tại tỷ lệ glutamate là 1%. Tuy nhiên, khi ni cấy ở mơi trường có tỷ lệ glutamate >1%, khả năng sinh trưởng của các chủng giảm dần. Vì vậy, chúng tơi chọn tỷ lệ glutamate 1% bổ sung vào mơi trường ni cấy trong các thì nghiệm tiếp theo.
Tóm lại
Từ những kết quả thu được sau các nghiên cứu về điều kiện nuôi cấy đối với 2 chủng vi khuẩn VTCC-B-439 và VTCC-B-411, chúng tôi đã lựa chọn môi trường để nuôi cấy là M2 (Glucose-20; K2HPO4-2; CH3COONa-5; diamonium hydrogen citrate-2; MgSO4-0,2; MnSO4-0,04; Tween 80-1; yeast extract-50,1) trong thời gian 2 ngày với nhiệt độ thích hợp là 350C ở pH = 6. Vi khuẩn được nuôi tĩnh với tỷ lệ giống cấy là 5%, nguồn nitơ là yeast extract, nguồn cacbon là lactose và tỷ lệ bổ
sung glutamate vào môi trường là 1%
3.5. Nghiên cứu phương pháp thu hồi, làm khô và bảo quản sinh khối chủng vi sinh vật
3.5.1. Thu hồi sinh khối các chủng vi khuẩn bằng phương pháp ly tâm Lựa chọn tốc độ ly tâm
Dịch nuôi các chủng vi khuẩn lactic Lactobacillus plantarum VTCCB439 và Lactobacillus casei VTCC411 từ thiết bị lên men, được ly tâm ở các tốc độ
khác nhau trong 10 phút. Thu lấy cặn và xác định số lượng tế bào còn lại trong phần dịch.
Bảng 3.5. Lựa chọn tốc độ ly tâm
STT Tốc độ ly tâm (vòng/phút)
Số lượng tế bào sót trong dịch sau ly tâm (CFU/ml) VTCC-B-439 VTCC-B-411 1 2000 6x108 6x108 2 5000 5x105 5x105 3 7000 2x104 2x104 4 8000 2x104 2x104
Kết quả bảng 3.5 cho thấy tốc độ ly tâm từ 7000 trở lên có thể thu được hồn tồn sinh khối. Dịch sau ly tâm chỉ có màu mơi trường trong khi đó số lượng tế bào vi khuẩn khơng cịn nhiều 104 CFU/ml trong khi đó mật độ tế bào ban đầu là 109
CFU/ml. Chúng tôi đã tiến hành kiểm tra vi sinh vật tạp nhiễm do quá trình thao tác (bằng cả kỹ thuật nhuộm soi và cấy kiểm tra trên môi trường thạch đĩa MRS và LB) đều không phát hiện vi sinh vật tạp nhiễm ngồi các chủng ni cấy. Như vậy có thể nói, với kỹ thuật ly tâm tại tốc độ 7000 v/phút trong 10 phút có thể thu được hầu hết sinh khối tế bào vi khuẩn trong dịch sau lên men. Việc tăng tốc độ ly tâm (8000 v/phút) hay kéo dài thời gian ly tâm 15-20 phút không tăng hiệu quả thu sinh khối tế bào ngược lại phần kết tủa tế bào trở nên bám chắc hơn vào đáy ống ly tâm không tiện cho thu sinh khối cho các bước tiếp theo.
3.5.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất mang và tỷ lệ phối trộn của chất mang đến khả năng sống của vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu: Lactobacillus plantarum VTCC-B- 439 và Lactobacillus casei VTCC-B-411 khơng có bào tử nên việc làm khơ trong bất kỳ hình thức nào như phun sấy hay đông khô đều dẫn đến sự chết và bất hoạt các tế bào dinh dưỡng ở tỷ lệ khác nhau. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn kỹ thuật đơng khơ là q trình làm khơ trong lạnh đối với sinh khối vi khuẩn thu
được sau lên men. Dịch sinh khối thu được sau bước ly tâm , bổ sung chất mang đạt độ khơ 55-60% có tác dụng bảo vệ tế bào, giảm tỷ lệ chết trong quá trình đơng khơ. Trong nghiên cứu này với tỷ lệ chất mang và dịch vi khuẩn 1:1 theo độ ẩm là 60%. Kết quả q trình đơng khơ các mẫu vi khuẩn được trình bày trong bảng 3.6 như sau:
Bảng 3.6. Số lượng vi khuẩn trong sản phẩm sau đông khô với các công thức chất mang khác nhau Công thức Chủng VTCC-B-439 Chủng VTCC-B-411 Đánh giá Thời gian (giờ) Mật độ CFU/g Thời gian (giờ) Mật độ CFU/g 1 13 8x108 12 1x109 Khá 2 13 5x1010 12 6x1010 Tốt 3 13 2x109 12 1x109 Khá 4 13 3x108 12 6x108 Kém 5 13 7x108 12 1x109 Khá 6 13 1x108 12 6x108 Kém
Kết quả trong bảng 3.6 cho thấy thời gian đông khô không chỉ phụ thuộc vào chất mang mà còn thuộc vào chủng vi khuẩn, dao dộng từ 12-14 giờ. Việc so sánh các công thức chất mang được tiến hành đồng thời cho mỗi chủng với 6 công thức từ 1-6 cho thấy: công thức 2 là công thức tốt hơn cả cho cả 2 chủng vi khuẩn nghiên cứu.
Chọn chất mang được xem là khâu quan trọng cho quá trình phát triển sản phẩm sinh khối đơng khơ dạng bột. Vai trị của chất mang là bảo vệ hoạt động sống của tế bào trong q trình đơng khơ tại nhiệt độ âm 30 đến âm 50oC.Thông thường một số đường như lactose, maltose hoặc sữa gầy được dùng cho mục đích này. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn 3 loại chất mang là dextrin, sữa gầy và lactose với 6 công thức khác nhau: riêng rẽ (công thức 4, 5 và 6) và phối trộn (1, 2 và 3). Kết quả cho thấy việc phối trộn giữa chất mang là nguồn cacbon và nitơ
(công thức 1, 2, 3 và 5) đều cho kết quả tốt hơn hẳn nếu chỉ dùng nguồn cacbon làm chất mang (4 và 6). Công thức 2 là công thức cho kết quả tốt nhất với mật độ tế bào vi khuẩn sống đạt 1010 CFU/g được dùng cho nghiên cứu phát triển sản phẩm.
3.6.3. Nghiên cứu điều kiện bảo quản sinh khối vi khuẩn lactic (dạng bột)
Mẫu sau khi đông khô chia thành các phần nhỏ (khoảng 20g), dán kín giữ trong điều kiện nhiệt độ khác nhau: -20oC, 4oC và nhiệt độ phòng (25-30oC).
Bảng 3.7. Mật độ vi khuẩn sau thời gian bảo quản trong điều kiện khác nhau
Chủng
ĐK bảo quản (oC)
Số lượng vi khuẩn (CFU/g) sau thời gian bảo quản (tháng)
0 1 2 3 4 5 6 VTCC- B-439 -20 7x1010 7x1010 7x1010 6x1010 6x1010 5x1010 4x1010 4 7x1010 6x1010 5x1010 3x1010 2x1010 9x109 6x1010 25-30 7x1010 4x1010 7x109 2x109 8x108 3x108 8x107 VTCC- B-411 -20 6x1010 6x1010 6x1010 5x1010 5x1010 5x1010 5x1010 4 6x1010 6x1010 5x1010 4x1010 3x1010 1x1010 8x109 25-30 6x1010 5x1010 2x1010 8x109 3x1010 7x108 1x108
Kết quả bảng 3.7 cho thấy điều kiện bảo quản ảnh hưởng lớn đến khả năng sống sót của chủng vi khuẩn trong chế phẩm. Trong tất cả các chủng, điều kiện bảo quản tại -20oC là tốt nhất sau đó là 4oC. Trong điều kiện này, số lượng tế bào sống giảm (so với ban đầu) nhưng không quá 10-30 lần. Lượng vi sinh vật sống giảm mạnh khi bảo quản trong điều kiện nhiệt thường, số lượng vi khuẩn sống sót giảm 50-100 lần có trường hợp (Lactobacillus plantarum VTCCB439) giảm 1000 lần sau 6 tháng bảo quản.
Tóm lại:
Thu hồi sinh khối sử dụng phương pháp ly tâm với tốc độ 7000 v/phút trong 10 phút có thể thu được hầu hết sinh khối tế bào vi khuẩn trong dịch sau lên men, thích hợp cho các nghiên cứu nhỏ ban đầu trong phịng thí nghiệm.
Sử dụng chất mang là lactose và sữa gầy theo tỷ lệ 1:1 mang lại hiệu quả cao nhất khi đông khô sinh khối các chủng vi khuẩn nghiên cứu, mật độ tế bào vi khuẩn sống đạt từ 1010 CFU/g. Điều kiện bảo quản sinh khối vi khuẩn tại-20oC cho kết quả tốt nhất, số lượng tế bào sống đạt 1010CFU/g sau 6 tháng bảo quản.
Trong quá trình bảo quản sinh khối chủng vi khuẩn nghiên cứu không bị nhiễm tạp các vi sinh vật gây bệnh như: Bacillus cereus, E. coli, Listeria spp., Salmonella spp. và Staphylococcus aureus, sản phẩm đảm bảo tính vệ sinh an tồn thực phẩm
theo TCVN.
3.6. Nghiên cứu điều kiện lên men tạo GABA trên lá chè cao bằng việc sử dụng chủng vi khuẩn lactic
3.6.1. Lựa chọn thời gian lên men thích hợp
Dựa vào kết quả khả năng lên men tạo GABA trên lá chè của các chủng vi khuẩn lactic ở dữ liệu Bảng 3.2 cho thấy, cả 2 chủng vi khuẩn đều có khả năng lên men chè đạt hàm lượng GABA cao nhất ở ngày lên men thứ 2. Vì vậy chúng tơi chọn thời gian lên men 2 ngày thích hợp cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.6.2. Lựa chọn tỷ lệ giống cấy thích hợp
Tương tự như tối ưu thời gian lên men, cấy 2, 5, 10, 15, 20% thể tích giống ni cấy vào trong các túi chè, trộn đều và hút hết khí bên trong túi ủ ở 35oC trong 2 ngày lên men . Sau đó tiến hành định lượng hàm lượng GABA trong chè lên men. Kết quả được thể hiện ở hình 3.14.