Tên mồi Trình tự mồi 5’ – 3’
Nhiệt độ gắn mồi Kích thước GmGLP1-35S-Forward GTGACAGATAGCTGGGCAATG 57oC ~ 881bp GmGLP1 - Reverse TTATTTCTTAGGAGCAAGCCTAGAC 2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
Phương pháp tạo vật liệu vô trùng và phương pháp chuyển gen vào cây đậu tương được tiến hành theo quy trình của Olhofl et al. (2003) [51] và Zhang (2004) [81] có cải tiến để phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm.
Tạo vật liệu vô trùng
Hạt đậu tương được đặt trong đĩa petri 15x100 mm thành một lớp đơn và đưa vào hộp hút khơ có chứa ca thủy tinh đựng hỗn hợp 100ml Clorox + 4ml HCl đặc. Hộp hút khơ được đóng kín và hạt giữ trong vịng 16h để khử trùng.
Nảy mầm hạt
Hạt đậu tương sau khi khử trùng được cấy trên đĩa mơi trường GM. Gói đĩa chứa hạt thành từng chồng 5 đĩa. Các chồng hạt được nuôi trong phịng ni cấy trong điều kiện: nhiệt độ 24oC, 18h sáng, 6h tối, với cường độ ánh sáng 100-150E trong vòng 5 ngày.
Chuẩn bị khuẩn biến nạp
Chủng khuẩn A.tumefaciens – EHA101 chứa vector pZY101Asc – mang gen
Bar chọn lọc glufosinate và gen cần chuyển GmGLP1 – được lưu giữ trong tủ -
80oC. Trước khi sử dụng khuẩn cho biến nạp thực vật, khuẩn được nuôi phục hồi trên mơi trường YEP đặc có bổ sung 4 loại kháng sinh chọn lọc vi khuẩn: 50mg/ml Spectomycin, 50mg/ml Streptomycin, 25mg/ml Rifamycin, và 25mg/ml Kanamycin. Nuôi khuẩn sau 3 ngày trên môi trường YEP đặc, thu khuẩn lạc và nuôi lắc trong 5ml môi trường YEP lỏng được bổ sung 4 loại kháng sinh chọn lọc (50mg/ml Spectomycin, 50mg/ml Streptomycin, 25mg/ml Rifamycin, và 25mg/ml
Kanamycin).Nuôi lắc trong 8 giờ, dịch khuẩn thu được được chuyển sang bình chứa 150ml YEP lỏng. Tiếp tục nuôi lắc khuẩn 16h ở 28oC , V = 250 v/p. Sử dụng máy đo OD ở bước sóng 650nm để kiểm tra mật độ tế bào có mặt trong dịch khuẩn nuôi cấy. OD650 khuẩn đạt giá trị nằm trong khoảng 1,0 – 1,2 được sử dụng để lây nhiễm cho thực vật. Ly tâm dịch khuẩn để thu cặn khuẩn ở 3500 v/p, 10 phút ở nhiệt độ phòng. Hòa tan lại cặn khuẩn sử dụng dung dịch CCM lỏng sao cho OD650 sau khi hòa tan đạt giá trị0,6. Dung dịch CCM lỏng có giá trị OD650 đạt 0,6 được gọi là dung dịch đồng nuôi cấy.
Đồng nuôi cấy
Nảy mầm hạt sau 5 ngày, loại bỏ phần trụ dưới lá mầm, tách đôi hai lá mầm ( ½ lá mầm sau đây sẽ được gọi là mẫu nuôi cấy) bằng dao nuôi cấy sao cho mỗi lá mầm chứa ½ chồi đỉnh. Loại bỏ chồi đỉnh trên mẫu nuôi cấy, gây tổn thương mẫu ni cấy tại vị trí nốt lá mầm khoảng 5 – 7 đường, mỗi đường sâu khoảng 0,5mm và dài khoảng 3 – 4 mm. Mẫu nuôi cấy đã gây tổn thương được ngâm trong dung dịch
đồng nuôi cấy khoảng 30 phút để lây nhiễm với vi khuẩn A.tumefaciens. Chuyển
mẫu nuôi cấy sang môi trường đồng nuôi cấy (môi trường CCM đặc). Nuôi mẫu trên môi trường CCM đặc trong 5 ngày ở điều kiện nhiệt độ 24oC, điều kiện ánh sáng: 18h sáng và 6h tối, cường độ ánh sáng 100 – 150E.
Kích thích ra chồi
Sau 5 ngày đồng nuôi cấy trên môi trường CCM đặc, loại bỏ khuẩn bám trên bề mặt mẫu nuôi cấy bằngmôi trường SIM lỏng trước khi chuyển sang môi trường SIM đặc. Giữ mẫu nuôi cấy trong môi trường SIM đặc trong 14 ngày nhằm kích thích vị trí gây tổn thương tạo cụm đa chồi. Chuyển mẫu nuôi cấy đã phát sinh được cụm đa chồi sang môi trường SIM đặc có chứa chất chọn lọc thực vật glufosinate nồng độ 10mg/l, nuôi mẫu nuôi cấy trong 14 ngày.
Kéo dài chồi
Những mẫu ni cấy sống sót qua chọn lọc được loại bỏ những chồi chết trên cụm chồi đồng thời được cắt loại bỏ phần trụ lá mầm. Chuyển tiếp mẫu nuôi cấy sang môi trường SEM chứa chất chọn lọc glufosinate nồng độ 5mg/ml giảm ½
so với mơi trường SIM đặc. Cứ sau 14 ngày tiến hành chuyển những mẫu sống sót xanh sang mơi trường SEM mới. Chú ý loại bỏ những chồi chết trong mỗi lần chuyển mẫu. Mẫu đýợc chuyển cho tới khi cụm đa chồi bật lęn đýợc chồi.
Kích thích ra rễ
Những chồi dài 3 – 4 cm trong cụm đa chồi, được cắt khỏi cụm đa chồi để kích thích ra rễ tái sinh cây hoàn chỉnh. Chồi sau khi được cắt khỏi cụm đa chồi được ngâm khoảng 2 – 5 phút trong dung dịch IBA 1 mg/ml. Chồi được nuôi trên môi trường RM cho tới khi chồi phát sinh rễ.Chuyển cây con sau khi tái sinh hồn chỉnh ( có thân, lá và rễ đầy đủ) ra đất.
Chọn lọc cây con ra đất bằng Basta
Tùy thuộc vào tốc độ thích ứng của phát triển của cây con ngồi mơi trường mà chọn thời gian phun basta cho hợp lý. Thương cây con được sử dụng trong thí nghiệm phun basta là những cây phát sinh khoảng 3 – 5 lá thật. Nồng độ basta sử dụng trong thí nghiệm chọn lọc là 100mg/l. Cây con sau khi phun basta được che chắn để giảm tác động của môi trường ( mưa, nắng, gió, sương…) tới kết quả phun basta. Thí nghiệm phun basta được tiến hành lặp lại 3 lần, mỗi lần cách nhau 3 ngày. Những cây con sống sót sau 3 lần phun basta, được tiếp tục chăm sóc làm vật liệu cho những phân tích đánh giá tiếp theo.
Chúng tôi sử dụng phương pháp chuyển gen thực vật thông qua A.
tumefaciens như được trình bày ở trên trong các thí nghiệm với 4 giống đậu tương:
ĐT22, ĐT26, DT84, và ĐVN9. Với từng giống, mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
2.3.2. Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ mẫu lá
Quy trình tách chiết ADN được tiến hành theo quy trình tách chiết ADN của Doyle et al. (1987) [27] được cải tiến cho phù hợp với điều kiện và hóa chất của phịng thí nghiệm.
Bước 1: Thu mẫu lá từ những cây con sống sót sau 3 lần phun basta. Giữ mẫu lá thu được trong nito lỏng, nghiền mẫu lá ngay sau khi thu mẫu.
Bước 2: Nghiền nhỏ 1 gam mẫu lá bằng chày cối sứ trong nito lỏng và chuyển vào ống eppendoft 2ml.
Bước 3: Bổ sung 1,5ml dung dịch đệm CTAB (xem phụ lục) mỗi ống eppendoft. Lắc đều mẫu và ủ mẫu trong bể ổn nhiệt ở 650C, t = 60 phút.
Bước 4: Ly tâm hỗn hợp dịch chiết mẫu lá V = 13000 v/p, t = 10 phút, ở 4oC. Bước 5: Thu dịch nổi, chuyển sang ống eppendoft 2ml. Bổ sung dung dịch 25 : 24 : 1 ( phenol : chloroform : isoamylalcohol ) vào ống chứa dịch chiết theo tỷ lệ 1 : 1. Lắc đều hỗn hợp và ly tâm ở 4oC, V = 13000 v/p, t = 10 phút.
Bước 6: Thu dịch nổi chuyển sang ống eppendoft 2ml. Bổ sung dung dịch chloroform: isoamylalcohol (24:1) theo tỷ lệ 1 : 1 vào ống chứa dịch chiết. Lắc đều hỗn hợp và ly tâm lạnh ở 4oC, V = 12000 v/p, t = 10 phút.
Bước 7: Thu dịch nổi chuyển sang ống eppendoft 1,5ml. Bổ sung dung dịch isopropanol theo tỷ lệ 1 : 1 vào ống chứa dịch chiết. Lắc nhẹ nhàng. Giữ mẫu trong tủ -20oCtrong vòng 2h. Ly tâm ở 4oC, V = 12000 v/p, t = 10 phút. Loại bỏ dịch nổi, giữ lại tủa ADN.
Bước 8: ADN được làm khô bằng cách mở nắp và để trong tủ hút trong vòng 2h. Hòa tan lại ADN bằng hỗn hợp NaCl 1M + Rnase 1mg/ml, ủ hỗn hợp ở tủ 37oC, t = 30 phút.
Bước 9:Bổ sung theo tỷ lệ 1 : 1 dung ethanol 100% vào hỗn hợp dung dịch ( ADN + NaCl 1M + Rnase 1mg/ml), giữ hỗn hợp ở tủ -20oC trong vòng 1h.
Bước 10: Ly tâm hỗn hợp ( ethanol 100% + ADN + NaCl 1M + Rnase 1mg/ml ) ở 4oC, V = 12000 v/p, t = 10 phút nhằm thu lại tủa ADN.
Bước 11: Rửa lại tủa ADN thu được ở bước 10 bằng dung dịch Ethanol 70%, ly tâm lạnh 4oC, V = 12000 v/p, t = 10 phút. Lặp lại bước này 2 lần.
Bước 12: Làm khô tủa ADN sử dụng máy hút chân không. Hòa tan ADN bằng nước cất khử ion. Bảo quản ADN trong tủ -20oC.
Bước 13: Kiểm tra chất lượng ADN tách chiết được bằng máy đo nanodrop và bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%.
2.3.3. Phương pháp nhân bản trình tự ADN bằng kỹ thuật PCR
Dung lượng hỗn hợp PCR cho mỗi mẫu là 20µl. Phản ứng PCR được tiến hành trên máy chu trình nhiệt model PTC-100.
Sau khi PCR kết thúc, 10µl dung dịch của mỗi ống phản ứng được điện di trên gel agarose 1% có bổ sung EtBr 0,05%, cùng với ADN marker (ADN chuẩn); sau đó, sản phẩm PCR được kiểm tra dưới đèn UV, chụp ảnh và đánh giá.