Trong các nghiên cứu từ trước tới nay, có hai phương pháp chọn lọc cây T0 đang được sử dụng: (i): chọn lọc bằng cách bôi glufosinate lên lá; (ii): chọn lọc sử dụng basta để phun hoặc bôi lá. Thực chất hai phương pháp này là như nhau, basta là một loại thuốc diệt cỏ mà có chứa 2% thành phần là glufosinate. Điều này có nghĩa, dùng phương pháp bôi lá bằng glufosinate hay chọn lọc bằng basta đều sử
dụng glufosinate để chọn lọc những cây mang và biểu hiện gen Bar. Năm 2004, Paz
và cs [56] sử dụng nồng độ glufosinate 150 mg/l để bôi lá cây T0. Năm 2013, Nguyễn Văn Đồng và cs [3] sử dụng phương pháp phun basta để chọn lọc cây sau chuyển gen với nồng độ basta 3ppm. Trong thí nghiệm này, chúng tơi đã thử nồng
độ basta , ở nồng độ 100 mg/l cho biểu hiện cây kháng rõ rệt nhất. Kết quả phun basta được trình bày trong bảng 13.
Bảng 13. Tỷ lệ cây sống sót sau khi phun basta
Tên giống Số cây con ban
đầu (cây) Số cây con sống sót (cây) Tỷ lệ cây sống sót (%) ĐT22 15 8 53,33 ĐVN9 7 0 0 ĐT26 8 6 75 DT84 2 2 100
3.2.2. Kiểm tra sự có mặt của gen cần chuyển GmGLP1 bằng kỹ thuật PCR
Những cây con sống sót sau khi phun Basta được thu lá để tách chiết ADN
để kiểm tra sự có mặt của gen GmGLP1 bằng kỹ thuật PCR. Để đảm bảo chất lượng
ADN, mẫu lá thu là những lá bánh tẻ mới ra sau lần phun Basta, mẫu sau khi thu xong được giữ trong nito lỏng và nghiền ngay. Thu khoảng 1 gram mẫu lá. Sử dụng quy trình CTAB [27] có cải tiến cho phù hợp theo điều kiện phịng thí nghiệm. Sau khi thu được ADN, kiểm tra chất lượng ADN bằng điện di và đo nanodrop. Kết quả điện di ADN mẫu lá như trong hình 6.
Hình 6a. Ảnh điện di kiểm tra chất lượng ADN tổng số cây T0 giống ĐT22 M: thang chuẩn 1kb plus; ĐT22: cây đậu tương ĐT22; ĐVN9: cây đậu tương ĐVN9
không chuyển gen; ĐT26: cây đậu tương ĐT26 không chuyển gen; DT84: cây đậu tương DT84 không chuyển gen;1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8: cây T0 giống đậu tương ĐT22
Hình 6b. Ảnh điện di kiểm tra chất lượng ADN tổng số cây T0 giống đậu tương ĐT26 và DT84
M: thang chuẩn DNA 1kb plus;9, 10, 11, 12, 13, 14: cây T0 giống đậu tương ĐT26; 15, 16: cây T0 giống đậu tương DT84
Hình 6. Ảnh điện di ADN tổng số cây đậu tương chuyển gen giống ĐT22 ở thế hệ T0
Trên ảnh điện di, mẫu ADN tổng số của các mẫu lá tương đối đồng đều, mẫu ĐVN9 cho băng không rõ, chứng tỏ lượng ADN thu được là ít. Tất cả các mẫu cho băng gọn không bị kéo vệt, điều này cho thấy ADN tách khơng bị đứt gãy và kích thước các băng đều nhau có kích thước 10kb.
Cặp mồi GmGLP1-35S-Forward/ GmGLP1-Reverseđã được sử dụng để kiểm tra sự có mặt của gen GmGLP1 trong các mẫu cây dương tính với phun Basta. Theo lý thuyết, kích thước đoạn gen GmGLP1 được nhân lên có kích thước 881 bp.
Hình 7a. Phân tích PCR gen cần chuyển - GmGLP1 trên cây đậu tương ĐT22 được chuyển gen thế hệ T0
M: thang ADN chuẩn 1kb; (-): đối chứng âm – H2O; (+): đối chứng dương – plasmid; ĐT22: cây đậu tương ĐT22 không chuyển gen; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8: cây T0
Hình 7b. Phân tích PCR gen cần chuyển - GmGLP1 trên cây đậu tương ĐT26 và DT84 được chuyển gen thế hệ T0
M: thang ADN chuẩn 1kb plus; (+): đối chứng dương – plasmid; (-): đối chứng âm – H2O; ĐT26 :cây đậu tương ĐT26 không chuyển gen; DT84: cây đậu
tương DT84 không chuyển gen; 9, 10, 11, 12, 13, 14: cây T0 giống đậu tương ĐT26;15 và 16: cây T0 giống đậu tương DT84
Hình 7. Phân tích PCR gen cần chuyển – GmGLP1 trên cây đậu tương ĐT22, ĐT26 và DT84 được chuyển gen thế hệ T0
Các cây dương tính với phản ứng PCR được tiếp tục chăm sóc để thu lá và hạt. Tuy nhiên, các cây T0 đều ít lá và ít quả. Do lượng lá ít nên khơng thể tiến hành
thu mẫu lá làm nguyên liệu cho lai Southern blot. Đồng thời, một số cây con bị chết do quá yếu sau các lần chọn lọc, một số cây con không cho hạt do bị nhiễm bệnh và trồng khơng đúng vụ như được trình bày trong bảng 14.
Bảng 14. Thống kê số cây T0 sinh trưởng và phát triển tốt sau khi phun basta và đã dương tính với PCR Tên giống Số mẫu ban đầu (mẫu) Cây sống sót sau chọn lọc Basta (cây) Cây dương tính khi kiểm tra PCR
(cây) Tần suất biến nạp T0 (%) ĐT22 750 8 7 0,93 ĐVN9 750 0 0 0 ĐT26 750 6 2 0,27 DT84 750 2 1 0,13
Năm 2012, Nguyễn Văn Đồng và cs [2] đã tiến hành thí nghiệm chuyển gen
GmMyb vào giống đậu tương ĐT22, cây chuyển gen thu được phân tích bằng
phương pháp phun Basta kết hợp với PCR kiểm tra đoạn gen đích; kết quả phân tích thu được tần suất chuyển gen trong khoảng từ 0,6 – 1,6%. So sánh với các nghiên cứu trước đây, theo nghiên cứu của Olhoft và cs (2003) [51], sử dụng chỉ thị chọn
lọc hygromycin nghiên cứu tăng hiệu suất biến nạp gen GUS vào giống đậu tương
Bert từ 0,7 % lên tới 16,4% bằng cách thêm vào môi trường lây nhiễm 3 chất: L- cysteine, diothiothreitol và sodium thiosulphate. Năm 2004, Zhang và cs [81] đã
công bố hiệu suất biến nạp gen GUS vào giống đậu tương mơ hình Williams 82 trong khoảng từ 0,1- 5,9% lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens qua vị trí tổn thương
nốt lá mầm. Cùng năm 2004, trong nghiên cứu của Paz và cs [56], hiệu suất biến
nạp gen GUS của hai giống đậu tương Williams 79 và Williams thu được lần lượt là 2,0% và 6,3% qua vi khuẩn A.tumefaciens chọn lọc thực vật bằng glufosinate. Có
hai điểm khác biệt cơ bản trong các nghiên cứu trước đây và nghiên cứu của chúng tôi: (i): các giống đậu tương sử dụng trong nghiên cứu đa phần là giống đậu tương
mơ hình: (ii): gen sử dụng trong các nghiên cứu trên đều là gen chỉ thị GUS. Từ các
giống đậu tương và gen đích chuyển trong nghiên cứu. So sánh với nghiên cứu của
chúng tôi, cùng giống đậu tương ĐT22, khác gen cần chuyển – GmGLP1 phương
pháp phân tích tương tự, chúng tôi thu được tần suất biến nạp là 0,93%. Kết quả nghiên cứu này tương ứng nằm trong khoảng kết quả nghiên cứu tần suất biến nạp của Nguyễn Văn Đồng và cs. Đối với giống đậu tương ĐVN9, chúng tôi không thu được cây chuyển gen. Tần suất biến nạp của giống đậu tương ĐT26 và DT84 lần lượt là 0,27% và 0,13%.
Như vậy, trong 4 giống đậu tương: ĐT22, ĐVN9, ĐT22 và DT84 được sử
dụng làm nguyên liệu trong quá trình chuyển gen GmGLP1, giống đậu tương ĐT22
có tần số biến nạp cao nhất (0,93%), giống đậu tương ĐVN9 không thu được cây chuyển gen. Tiếp tục chăm sóc cây chuyển gen để thu hạt làm nguyên liệu cho những phân tích ở thế hệ tiếp theo. Tuy nhiên, giống đậu tương ĐT26 và DT84, cây con thu được không cho quả và hạt, trong số 7 cây chuyển gen giống ĐT22 chỉ có 4 cây ĐT22 là cho quả và hạt (hình 8 và hình 9).
Hình 8. Cây đậu tương chuyển gen dương tính với PCR giống ĐT22 ở thế hệ T0
3.3. Phân tích cây chuyển gen ở thế hệ T1
Hạt của cây T0 sau khi thu được gieo vào vụ xuân hè, gieo tất cả hạt T0 thu được để tiến hành đánh giá: (i): tỷ lệ kháng thuốc diệt cỏ Basta; (ii): phân tích southern blot.
Hình 10. Phản ứng của cây chuyển gen ở thế hệ T1 với Basta
Nồng độ Basta sử dụng cho việc chọn lọc cây T1 là 100 mg/l bằng với nồng độ phun chọn lọc cây T0. Năm 2006, Zhang và cs [78], sử dụng phương pháp bôi lá với 2% glufosinate. Cùng năm 2006, Margie và cs[57] chọn lọc cây T1 sau hai tuần
này mầm bằng Liberty nồng độ 250 mg/l để xác nhận sự có mặt gen Bar.
Bảng 15. Phân tích cây T1 chuyển gen dựa vào tỷ lệ phân ly 3:1 và 15:1
Giống đậu tương Dòng T0 Kháng Basta Mẫn Basta Giá trị 2 với tỷ lệ phân ly 3:1 So sánh giá trị 2 với giá trị tới hạn 3,841 ( = 0,05; df = 1 ) Giá trị 2 với tỷ lệ phân ly 15:1 So sánh giá trị 2 với giá trị tới hạn 3,841 ( = 0,05; df = 1 ) ĐT22 Q 1.5 12 6 0,667 < 3,841 22,533 > 3,841 Q 1.7 15 2 1,918 < 3,841 0,882 < 3,841
Q 2.1 12 7 1,421 < 3,841 30,347 > 3,841
Q 3.4 1 5 3,761 < 3,841 60,844 > 3,841
Dựa vào bảng 15, dịng Q1.5, Q2.1 và Q3.4 có giá trị 2 nhỏ hơn 3,841 khi xét tỷ lệ phân ly 3:1 và lớn hơn giá trị 3,841 khi xét tỷ lệ phân ly 15:1. Từ giá trị 2 nhận được, có thể kết luận bước đầu là: các cây T1 của các dòng Q1.5, Q2.1 và Q3.4 được hình thành từ các cây T0 tương ứng mang 1 bản copy của gen GmGLP1 được chèn vào hệ gen. Tuy nhiên chúng tôi cũng lưu ý rằng, do tổng số cây trong phân tích thống kê cho dịng 4 chỉ có 6 cây – trong đó duy nhất 1 cây có biểu hiện kháng khi chọn lọc Basta – nên cũng không ngoại trừ khả năng kết quả thống kê 2 không
phản ánh chính xác sự có mặt 1 bản copy của gen GmGLP1 trong trường hợp
này.Riêng đối với dòng Q1.7, kết quả phân tích thống kê cho thấy giá trị 2 đều nhỏ hơn giá trị tới hạn 3,841 khi so sánh với tỷ lệ phân ly 3:1 và tỷ lệ phân ly 15:1. Như vậy để khẳng định được số bản copy – một hay hai – thực sự được chèn vào trong hệ gen (từ thế hệ T0) của dòng Q1.7, cần phải tiếp tục làm những phân tích tiếp sau.
Để tiếp tục phân tích, chúng tơi chọn ra từ các dòng cây T1 chuyển gen mỗi dòng 2 cây để phục vụ cho việc phân tích Southern blot. Kết quả tách chiết ADN
được trình như ở dưới:
M: thang ADN chuẩn 1 kb plus; 1,2: mẫu cây T1 dòng Q1.5; 3,4: mẫu cây T1 dòng Q1.7; 5,6: mẫu cây T1 dòng Q2.1; 7: mẫu cây T1 dịng Q3.4; 8: mẫu ĐT22 khơng chuyển gen
Chất lượng ADN tổng số tương đối tốt, không bị đứt gẫy nhưng hàm lượng các mẫu không đồng đều; nguyên nhân là do lượng mẫu lá thu không đều nhau. Chất lượng ADN như trên hình đủ tiêu chuẩn để được sử dụng trong phân tích tiếp theo.
Sử dụng cặp mồi GmGLP1-35S-Forward/ GmGLP1-Reversecho phản ứng
PCR kiểm tra cây T1. Kết quả thu được như sau:
Hình 12. PCR kiểm tra sự có mặt của gen GmGLP1 trong cây T1
M: thang ADN chuẩn 1 kb plus;(+): đối chứng dương – plasmid; (-): đối chứng âm – H2O; Q1.5/3 và Q1.5/8: cây chuyển gen số 3 và số 8 dòng Q1.5; ; Q1.7/7 và Q1.7/9: cây chuyển gen số 7 và số 9 dòng Q1.7; Q2.1/4 và Q2.1/5:cây chuyển gen số 4 và số 5 dòng Q2.1; Q3.4/1: cây chuyển gen số 1 dịng Q3.4; ĐT22: cây ĐT22 khơng chuyển gen.
Hình 12 cho thấy, đối chứng dương plasmid cho băng đậm nét, đối chứng âm - H2O - không cho băng, điều này chứng tỏ phản ứng PCR diễn ra bình thường và có độ tin cậy. Cây chuyển gen của các dòng T1, tuy các băng hiện độ đậm nhạt khác nhau nhưng các băng đều rõ ràng và sáng nét, riêng dịng Q3.4, băng có kích thước
bằng băng kích thước của plasmid ~ 881 bp mờ hơn so với các dịng khác, ngồi ra, còn xuất hiện thêm 1 băng phụ.
Tiếp tục phân tích các dịng dương tính PCR bằng kỹ thuật lai Southern Blot. Mẫu dò sử dụng trong kỹ thuật lai Southern blot được sử dụng từ chính đoạn gen
GmGLP1 nội sinh của cây không chuyển gen và kéo dài thêm một đoạn khoảng 25
bp về phía promoter 35S.
Kết quả cắt giới hạn bằng enzyme BamHI và kết quả lai Southern blot được trình bày trong hình 13.
Hình 13. Kết quả lai Southern Blot
M: Thang chuẩn ADN 1 kb plus; ĐT22: cây không chuyển gen;Q1.5/3 và Q1.5/8: cây chuyển gen ở thế hệ T1 dòng cây chuyển gen Q1.5; Q1.7/7 và Q1.7/9: cây chuyển gen ở thế hệ T1 dòng cây chuyển gen Q1.7; Q2.1/4 và Q2.1/5: cây chuyển gen ở thế hệ T1 dòng cây chuyển gen Q2.1; Q3.4/1: cây chuyển gen ở thế hệ T1 dòng cây chuyển gen Q3.4
Từ kết quả lai Southern cho thấy:
- Cây ĐT22 cho ba băng và tất cả những dòng chuyển gen cũng cho băng bằng với băng của cây ĐT22. Có hai lý do để lý giải cho kết quả Southern blot hiện băng ở cả cây không chuyển gen: (i): Theo Lu và cs [47], trong hệ gen của đậu
tương, họ GmGLP1 có 21 gen, gen GmGLP1 được phân bố ở hai vị trí trong hệ gen,
trong quá trình cắt bởi enzym cắt giới hạn BamHI sẽ cho ra những đoạn có kích
thước khác nhau; (ii): mẫu dò sử dụng trong nghiên cứu là đoạn gen GmGLP1 nội sinh từ cây đậu tươngđược tổng hợp dựa trên sự bắt cặp của cặp mồiGmGLP1-35S- Forward/ GmGLP1-Reverse.
- Dòng cây chuyển gen Q1.5 và Q1.7 ngoài băng cùng với băng của cây ĐT22 cịn có thêm một băng bằng nhau ở vị trí khác nằm trong khoảng 2000 bp tới 3000 bp. Điều này chứng tỏ, dòng Q1.5 và dòng Q1.7 được xuất phát từ một nguồn ban đầu. Điều này có thể xảy ra bởi, trong q trình phát sinh đa chồi, chồi nào bật lên dài trước sẽ được cắt và kích thích ra rễ, cụm đa chồi lại được tiếp tục nuôi để tạo chồi mới; nhiều khả năng là do hai chồi được cắt ra có cùng nguồn gốc.
- Dòng Q2.1 và dịng Q3.4, ngồi băng trùng với băng của cây ĐT22 khơng có băng nào khác. Điều này chứng tỏ rằng, hệ gen của cây chuyển gen thế hệ T1 của
hai dòng cây chuyển gen Q2.1 và Q3.4 không mang đoạn gen GmGLP1 cần chuyển.
Kết hợp kết quả phun Basta, kết quả PCR và kết quả lai Southern blot để đưa ra kết luận về số lượng bản copy ở cây T1, số liệu được trình bày như trong bảng 16.
Bảng 16. Kết quả phân tích cây chuyển gen T1
Giống đậu tương Dịng T0 Dịng T1 Giá trị 2 với tỷ lệ phân ly 3:1 Giá trị 2 với tỷ lệ phân ly 15:1 PCR Southern blot ĐT22 Q1.5 Q1.5/3 2 < 3,841 2> 3,841 + + Q1.5/8 + + Q1.7 Q1.7/7 2 < 3,841 2< 3,841 + + Q1.7/9 + + Q2.1 Q2.1/4 2 < 3,841 2> 3,841 + -
Q2.1/5 + -
Q3.4 Q3.4/1 2
< 3,841 2> 3,841 + -
+: dương tính; - : âm tính
Từ kết quả phân tích cây đậu tương ĐT22 chuyển gen GmGLP1 ở thế hệ
T1trong bảng 16 rút ra được một số nhận xét như sau:
(i): Từ kết quả phân tích tỷ lệ cây kháng và cây mẫn với basta, kết quả PCR và kết quả Southern blot kết luận được rằng các cây T1 của dòng cây chuyển gen Q1.5 và dịng Q1.7 được hình thành tương ứng từ các cây T0 có duy nhất một bản
copy của gen GmGLP1 chèn vào trong hệ gen. Vị trí băng trong Southern blot của
dịng số 1 và dịng số 2 trùng lặp về kích thước, cho thấy rằng hai dòng thực chất được xuất phát từ cùng một nguồn gốc. Tiếp tục phân tích hai dịng cây chuyển gen Q1.5 và dòng Q1.7 ở thế hệ tiếp theo để tìm ra dịng thuần.
(ii): Dịng cây chuyển gen Q2.1, kết quả phân tích thống kê cho thấy rằngcác cây T1 được hình thành từ cây T0 mang 1 bản copy của gen GmGLP1 chèn vào trong hệ gen. Kết quả PCR cũng cho thấy rằng các cây T1 kháng với Basta được
kiểm tra đều mang gen GmGLP1 ngoại sinh. Tuy nhiên kết quả Southern blot
không cho băng, một khả năng là do sự chuẩn bị mẫu chưa đủ tốt. Để có thể khẳng
định được chính xác số lượng bản copy của gen GmGLP1 trong hệ gen cần tiếp tục