Những cây con sống sót sau khi phun Basta được thu lá để tách chiết ADN
để kiểm tra sự có mặt của gen GmGLP1 bằng kỹ thuật PCR. Để đảm bảo chất lượng
ADN, mẫu lá thu là những lá bánh tẻ mới ra sau lần phun Basta, mẫu sau khi thu xong được giữ trong nito lỏng và nghiền ngay. Thu khoảng 1 gram mẫu lá. Sử dụng quy trình CTAB [27] có cải tiến cho phù hợp theo điều kiện phịng thí nghiệm. Sau khi thu được ADN, kiểm tra chất lượng ADN bằng điện di và đo nanodrop. Kết quả điện di ADN mẫu lá như trong hình 6.
Hình 6a. Ảnh điện di kiểm tra chất lượng ADN tổng số cây T0 giống ĐT22 M: thang chuẩn 1kb plus; ĐT22: cây đậu tương ĐT22; ĐVN9: cây đậu tương ĐVN9
không chuyển gen; ĐT26: cây đậu tương ĐT26 không chuyển gen; DT84: cây đậu tương DT84 không chuyển gen;1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8: cây T0 giống đậu tương ĐT22
Hình 6b. Ảnh điện di kiểm tra chất lượng ADN tổng số cây T0 giống đậu tương ĐT26 và DT84
M: thang chuẩn DNA 1kb plus;9, 10, 11, 12, 13, 14: cây T0 giống đậu tương ĐT26; 15, 16: cây T0 giống đậu tương DT84
Hình 6. Ảnh điện di ADN tổng số cây đậu tương chuyển gen giống ĐT22 ở thế hệ T0
Trên ảnh điện di, mẫu ADN tổng số của các mẫu lá tương đối đồng đều, mẫu ĐVN9 cho băng không rõ, chứng tỏ lượng ADN thu được là ít. Tất cả các mẫu cho băng gọn không bị kéo vệt, điều này cho thấy ADN tách khơng bị đứt gãy và kích thước các băng đều nhau có kích thước 10kb.
Cặp mồi GmGLP1-35S-Forward/ GmGLP1-Reverseđã được sử dụng để kiểm tra sự có mặt của gen GmGLP1 trong các mẫu cây dương tính với phun Basta. Theo lý thuyết, kích thước đoạn gen GmGLP1 được nhân lên có kích thước 881 bp.
Hình 7a. Phân tích PCR gen cần chuyển - GmGLP1 trên cây đậu tương ĐT22 được chuyển gen thế hệ T0
M: thang ADN chuẩn 1kb; (-): đối chứng âm – H2O; (+): đối chứng dương – plasmid; ĐT22: cây đậu tương ĐT22 không chuyển gen; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8: cây T0
Hình 7b. Phân tích PCR gen cần chuyển - GmGLP1 trên cây đậu tương ĐT26 và DT84 được chuyển gen thế hệ T0
M: thang ADN chuẩn 1kb plus; (+): đối chứng dương – plasmid; (-): đối chứng âm – H2O; ĐT26 :cây đậu tương ĐT26 không chuyển gen; DT84: cây đậu
tương DT84 không chuyển gen; 9, 10, 11, 12, 13, 14: cây T0 giống đậu tương ĐT26;15 và 16: cây T0 giống đậu tương DT84
Hình 7. Phân tích PCR gen cần chuyển – GmGLP1 trên cây đậu tương ĐT22, ĐT26 và DT84 được chuyển gen thế hệ T0
Các cây dương tính với phản ứng PCR được tiếp tục chăm sóc để thu lá và hạt. Tuy nhiên, các cây T0 đều ít lá và ít quả. Do lượng lá ít nên khơng thể tiến hành
thu mẫu lá làm nguyên liệu cho lai Southern blot. Đồng thời, một số cây con bị chết do quá yếu sau các lần chọn lọc, một số cây con không cho hạt do bị nhiễm bệnh và trồng khơng đúng vụ như được trình bày trong bảng 14.
Bảng 14. Thống kê số cây T0 sinh trưởng và phát triển tốt sau khi phun basta và đã dương tính với PCR Tên giống Số mẫu ban đầu (mẫu) Cây sống sót sau chọn lọc Basta (cây) Cây dương tính khi kiểm tra PCR
(cây) Tần suất biến nạp T0 (%) ĐT22 750 8 7 0,93 ĐVN9 750 0 0 0 ĐT26 750 6 2 0,27 DT84 750 2 1 0,13
Năm 2012, Nguyễn Văn Đồng và cs [2] đã tiến hành thí nghiệm chuyển gen
GmMyb vào giống đậu tương ĐT22, cây chuyển gen thu được phân tích bằng
phương pháp phun Basta kết hợp với PCR kiểm tra đoạn gen đích; kết quả phân tích thu được tần suất chuyển gen trong khoảng từ 0,6 – 1,6%. So sánh với các nghiên cứu trước đây, theo nghiên cứu của Olhoft và cs (2003) [51], sử dụng chỉ thị chọn
lọc hygromycin nghiên cứu tăng hiệu suất biến nạp gen GUS vào giống đậu tương
Bert từ 0,7 % lên tới 16,4% bằng cách thêm vào môi trường lây nhiễm 3 chất: L- cysteine, diothiothreitol và sodium thiosulphate. Năm 2004, Zhang và cs [81] đã
công bố hiệu suất biến nạp gen GUS vào giống đậu tương mơ hình Williams 82 trong khoảng từ 0,1- 5,9% lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens qua vị trí tổn thương
nốt lá mầm. Cùng năm 2004, trong nghiên cứu của Paz và cs [56], hiệu suất biến
nạp gen GUS của hai giống đậu tương Williams 79 và Williams thu được lần lượt là 2,0% và 6,3% qua vi khuẩn A.tumefaciens chọn lọc thực vật bằng glufosinate. Có
hai điểm khác biệt cơ bản trong các nghiên cứu trước đây và nghiên cứu của chúng tôi: (i): các giống đậu tương sử dụng trong nghiên cứu đa phần là giống đậu tương
mơ hình: (ii): gen sử dụng trong các nghiên cứu trên đều là gen chỉ thị GUS. Từ các
giống đậu tương và gen đích chuyển trong nghiên cứu. So sánh với nghiên cứu của
chúng tôi, cùng giống đậu tương ĐT22, khác gen cần chuyển – GmGLP1 phương
pháp phân tích tương tự, chúng tơi thu được tần suất biến nạp là 0,93%. Kết quả nghiên cứu này tương ứng nằm trong khoảng kết quả nghiên cứu tần suất biến nạp của Nguyễn Văn Đồng và cs. Đối với giống đậu tương ĐVN9, chúng tôi không thu được cây chuyển gen. Tần suất biến nạp của giống đậu tương ĐT26 và DT84 lần lượt là 0,27% và 0,13%.
Như vậy, trong 4 giống đậu tương: ĐT22, ĐVN9, ĐT22 và DT84 được sử
dụng làm nguyên liệu trong q trình chuyển gen GmGLP1, giống đậu tương ĐT22
có tần số biến nạp cao nhất (0,93%), giống đậu tương ĐVN9 không thu được cây chuyển gen. Tiếp tục chăm sóc cây chuyển gen để thu hạt làm nguyên liệu cho những phân tích ở thế hệ tiếp theo. Tuy nhiên, giống đậu tương ĐT26 và DT84, cây con thu được không cho quả và hạt, trong số 7 cây chuyển gen giống ĐT22 chỉ có 4 cây ĐT22 là cho quả và hạt (hình 8 và hình 9).
Hình 8. Cây đậu tương chuyển gen dương tính với PCR giống ĐT22 ở thế hệ T0