Các bước Khởi động nóng Biến tính Gắn mồi Kéo dài Ổn định Giữ mẫu
Nhiệt độ 95oC 95oC 57oC 72oC 72oC 4oC
Thời gian 5 phút 30 giây 30 giây 90 giây 10 phút ∞
Số chu kỳ 35
2.3.4. Phương pháp thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR được thu nhận và tinh sạch để sử dụng làm ADN mẫu dị trong kỹ thuật lai Southern Blot. Q trình tinh chế nhằm thu lại ADN đích và loại bỏ các thành phần khác đặc biệt là mồi thừa trong hỗn hợp PCR có ảnh hưởng xấu đến hiệu quả gắn của mẫu dị với trình tự đích.
Bộ hóa chất Quick Gel Extraction Kit và quy trình kèm theo được sử dụng để tinh sạch sản phẩm PCR. Các bước thôi gel được tiến hành theo chỉ dẫn của hãng sản xuất. Sau khi PCR, sản phẩm được kiểm tra trên gel agrose 1% có bổ sung 0,05% EtBr, điện di trong khoảng 1 giờ 30 phút (U = 100V, I = 100 mA), soi UV để vạch gel. Gel thu được được thực hiện các bước thôi gel:
Bước 1: Băng ADN từ bản gel agarose được cắt bằng dao cắt gel và chuyển vào ống eppendorf 1,5ml đã được cân và chú thích trọng lượng ống.
Bước 2: Cân ống eppendorf 1,5 ml chứa gel để xác định trong lượng của gel, sau đó bổ sung dung dịch L3 buffer theo tỷ lệ 3:1 vào ống. Ủ hỗn hợp buffer L3 và gel ở 50oC trong vòng 10 phút, cứ 3 phút đảo ống gel một lần.
Bước 3: Mẫu được chuyển sang cột Gel Extraction; ly tâm ở nhiệt độ phòng V = 13000 v/p, t = 1 phút. Thu lại cột Gel, loại bỏ phần dịch.
Bước 4: Rửa cột Gel bằng dung dịch rửa ( WB ). Bổ sung dung dịch WB theo tỷ lệ thể tích 1 : 1 so với thể tích mẫu đã cho lên cột. Ly tâm lạnh ở 4oC, V = 13000 v/p, t = 1 phút. Loại bỏ phần dịch. Bước này được lặp lại 2 lần.
Bước 5: Ly tâm cột Gel ở 4oC, V = 13000 v/p, t = 1 phút nhằm loại bỏ hoàn toàn dịch rửa WB.
Bước 6: Chuyển cột Gel sang ống eppendorf mới. Bổ sung 30 µl dung dịch EB lên cột Gel, mẫu được giữ ở nhiệt độ phòng trong khoảng 5 – 10 phút. Ly tâm mẫu ở 4oC, V = 13000 v/p, t = 1 phút.
Bước 7: Mẫu được bảo quản trong tủ -20oC và được sử dụng làm mẫu dò trong phương pháp lai Southern blot.
2.3.5. Phương pháp lai Southern blot
Phương pháp lai Southern blot được thực hiện theo Southern (Southern, 1975) [69], sử dụng bộ kit DIG high prime I cùng protocol đi kèm bộ kit; ngoài ra tham khảo thêm protocol Southern blot Sambrook (2001) [64] và có cải tiến cho phù hợp với phịng thí nghiệm. ADN tổng số được sử dụng trong kỹ thuật lai Southern blot được tách chiết và tinh sạch theo phương pháp tách chiết ADN của Doyle (1987) [27].
Mẫu dò ADN
Bước 1: Khuếch đại đoạn gen GmGLP1 ADN khuôn được sử dụng là plasmid. Cặp mồi GmGLP1-35S-Forward/ GmGLP1-Reverse. Sản phẩm PCR được
Bước 2: Thu nhận và tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit thôi gel Quick Gel Extraction Kit (như trình bày trong mục 2.3.4)
Bước 3: Sử dụng 1 µg đến 3 µg hàm lượng ADN làm mẫu dị (ADN khn) . Bước 4: Biến tính ADN khn ở 100oC trong 10 phút.
Bước 5: 16µl ADN khn sau biến tính được cho phản ứng với 4 µl DIG – High Prime, ủ ở 37oC trong 20h để phản ứng tổng hợp mẫu dị diễn ra hồn tồn.
Bước 6: Dừng phản ứng tổng hợp mẫu dò ở 65oC trong 10 phút. Bảo quản mẫu dò ở tủ -20oC.
Mẫu dò sau khi tổng hợp có kích thước ~881 bp bằng kích thước đoạn gen
GmGLP1 được biến nạp vào cây đậu tương. Phản ứng cắt giới hạn ADN
Bước 1: Phản ứng cắt giới hạn bằng emzyme BamHI, thành phần phản ứng
như trong bảng , ủ hỗn hợp ở 37oC trong 20h.