3.1. Kết quả đánh giá khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh của 4 giống đậu tương
3.1.2. Khả năng tái sinh tạo đa chồi
Sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường lây nhiễm, mẫu được chuyển sang mơi trường SIM có chứa chất kích thích sinh trưởng BAP 1,67mg/l. Rất nhiều nghiên cứu về sự ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng lên sự tái sinh tạo đa chồi chỉ ra rằng: các chất kích thích sinh trưởng điển hình là BAP – đóng vai trị rất lớn trong sự sinh trưởng, phát triển và khả năng phát chồi của mẫu nuôi cấy. Theo nghiên cứu của Trejgell A và cs (2013) [73], các nồng độ khác nhau của BAP có ảnh hưởng khác nhau lên khả năng hình thành chồi và đa chồi ở cây đậu tương. Ngồi ra, theo Trần Thị Cúc Hịa [5] nghiên cứu khả năng đáp ứng chuyển nạp gen của các giống đậu tương ở Việt Nam đã chỉ ra rằng khả năng tiếp nhận gen của các
vậy, khả năng tái sinh tạo đa chồi phụ thuộc vào hai yếu: (i) phụ thuộc vào nồng độ chất kích thích sinh trưởng BAP trong mơi trường ni cấy; (ii) phụ thuộc vào đặc tính của giống đậu tương, các giống khác nhau sẽ cho tỷ lệ đa chồi khác nhau.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng BAP nồng độ 1,67 mg/l cho q trình kích thích tạo đa chồi của 4 giống đậu tương – ĐT22, ĐVN9, ĐT26 và DT84; sở dĩ, chúng tôi lựa chọn BAP nồng độ 1,67 mg/l do trong đa số những nghiên cứu trước đây [56, 51]… đều sử dụng BAP nồng độ 1,67 mg/l trong môi trường kích thích tạo đa chồi. Sau 14 ngày cảm ứng tạo chồi, kết quả thu được được thể hiện trong bảng 10. Tỷ lệ phát sinh đa chồi của giống ĐVN9 là cao nhất với tỷ lệ mẫu đa chồi là 62,40% tiếp đến là giống đậu tương ĐT22 (51,07%), giống DT84 có tỷ lệ mẫu phát sinh đa chồi thấp nhất (33,30%). Mặc dù trong quá trình tái sinh tạo đa chồi, ngồi những mẫu có khả năng tạo đa chồi và những mẫu chết do không tạo được chồi cịn có những mẫu phát sinh lại chồi đỉnh. Những mẫu phát sinh chồi đỉnh được loại bỏ; do đó, coi những mẫu phát sinh chồi đỉnh là mẫu chết. Nguyên nhân phát sinh chồi đỉnh là do trong quá trình thao tác gây tổn thương lây nhiễm khuẩn khơng loại bỏ hồn tồn đỉnh sinh trưởng trên nửa lá mầm.
Bảng 9. Khả năng phát sinh chồi của 4 giống đậu tương nghiên cứu sau 14 ngày
STT Giống Số mẫu
lây nhiễm (mẫu)
Số mẫu phát sinh đa chồi
(mẫu) Số mẫu chết (mẫu) Tỷ lệ mẫu phát sinh đa chồi (%) 1 ĐT22 750 383 367 51,07 2 ĐVN9 750 468 282 62,40 3 ĐT26 750 300 450 40,00 4 DT84 750 250 500 33,33
Tái sinh tạo đa chồi là một bước quan trọng cho sự thành cơng của q trình chuyển gen. Bước tiếp sau của quá trình chuyển gen là chọn ra được các chồi mang
gen cần chuyển. Vi khuẩn A. tumefaciens sử dụng cho biến nạp có chứa vector nhị thể pZY101Asc, ngoài chứa gen đích cần chuyển là gen GmGLP1 còn chứa thêm một đoạn gen Bar đóng vai trị làm chỉ thị chọn lọc thực vật. Hệ thống vector chứa gen Bar làm chỉ thị chọn lọc thực vật đã được sử dụng rất nhiều trong các nghiên
nồng độ glufosinate khác nhau trong môi trường chọn lọc. Năm 1999, Zhang và cs [82] chỉ ra rằng khả năng tái sinh chồi bị ức chế khi sử dụng nồng độ glufosinte 10 mg/l cho giống A 3237. Nhưng năm 2007, theo Trần Thị Cúc Hòa [5], glufosinate nồng độ 10 mg/l trong môi trường chọn lọc là phù hợp với hầu hết giống đậu tương và nồng độ 5 mg/l cho môi trường kéo dài chồi tiếp theo; trong nghiên cứu này Trần Thị Cúc Hòa sử dụng 4 giống đậu tương để nghiên cứu là: MTĐ176, HL202, Maverick và Williams 82. Paz và cs (2004) [56] đã sử dụng nồng độ glufosinate 6 mg/l trong suốt quá trình chọn lọc tức là từ giai đoạn sau phát sinh đa chồi cho tới giai đoạn kéo dài chồi. Năm 2013, Nguyễn Văn Đồng và cs [3] sử dụng glufosinate nồng độ 10 mg/l trong mơi trường chọn lọc và duy trì nồng độ glufosinate trong mơi
trường kéo dài lóng là 5 mg/l trong nghiên cứu chuyển nạp gen GmMyb vào giống
đậu tương ĐT22. Dựa vào kết quả những nghiên cứu trước đây, chúng tôi sử dụng nồng độ glufosinate trong lần chọn lọc đầu tiên là 10 mg/l và 5 mg/l cho môi trường chọn lọc kéo dài chồi tiếp sau.
Bảng 10. Khả năng sống sót sau chọn lọc và khả năng kéo dài chồi của 4 giống đậu tương ĐT22, ĐVN9, ĐT26 và DT84
STT Giống Số mẫu tạo
đa chồi (mẫu) Số mẫu sống sót qua chọn lọc (mẫu) Số mẫu chết (mẫu) Tỷ lệ sống sót qua chọn lọc (%) 1 ĐT22 383 198 185 51,70 2 ĐVN9 468 168 300 35,90 3 ĐT26 300 56 244 18,70 4 DT84 250 68 182 27,20