Giống đậu tương Dòng T0 Dòng T1 Giá trị 2 với tỷ lệ phân ly 3:1 Giá trị 2 với tỷ lệ phân ly 15:1 PCR Southern blot ĐT22 Q1.5 Q1.5/3 2 < 3,841 2> 3,841 + + Q1.5/8 + + Q1.7 Q1.7/7 2 < 3,841 2< 3,841 + + Q1.7/9 + + Q2.1 Q2.1/4 2 < 3,841 2> 3,841 + -
Q2.1/5 + -
Q3.4 Q3.4/1 2
< 3,841 2> 3,841 + -
+: dương tính; - : âm tính
Từ kết quả phân tích cây đậu tương ĐT22 chuyển gen GmGLP1 ở thế hệ
T1trong bảng 16 rút ra được một số nhận xét như sau:
(i): Từ kết quả phân tích tỷ lệ cây kháng và cây mẫn với basta, kết quả PCR và kết quả Southern blot kết luận được rằng các cây T1 của dòng cây chuyển gen Q1.5 và dịng Q1.7 được hình thành tương ứng từ các cây T0 có duy nhất một bản
copy của gen GmGLP1 chèn vào trong hệ gen. Vị trí băng trong Southern blot của
dòng số 1 và dịng số 2 trùng lặp về kích thước, cho thấy rằng hai dịng thực chất được xuất phát từ cùng một nguồn gốc. Tiếp tục phân tích hai dịng cây chuyển gen Q1.5 và dịng Q1.7 ở thế hệ tiếp theo để tìm ra dịng thuần.
(ii): Dòng cây chuyển gen Q2.1, kết quả phân tích thống kê cho thấy rằngcác cây T1 được hình thành từ cây T0 mang 1 bản copy của gen GmGLP1 chèn vào trong hệ gen. Kết quả PCR cũng cho thấy rằng các cây T1 kháng với Basta được
kiểm tra đều mang gen GmGLP1 ngoại sinh. Tuy nhiên kết quả Southern blot
không cho băng, một khả năng là do sự chuẩn bị mẫu chưa đủ tốt. Để có thể khẳng
định được chính xác số lượng bản copy của gen GmGLP1 trong hệ gen cần tiếp tục
tiến hành các phân tích tương tự ở thế hệ tiếp theo.
(iii): Đối với dòng cây chuyển gen Q3.4, kết quả PCR hiện băng nhạt và kết quả Southern blot âm tính đồng thời số lượng mẫu ban đầu quá ít, cây sống sau khi phun basta thấp. Loại bỏ dịng số 4, khơng tiếp tục phân tích ở những thế hệ tiếp theo.
Như vậy, dòng cây đậu tương ĐT22 đã được chuyển gen Q1.5, Q1.7 và Q2.1 được tiếp tục phân tích sự phân ly ở thế hệ tiếp theo để tìm ra dịng thuần mang gen
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
1. Giống đậu tương ĐT22 có khả năng tái sinh cụm chồi (51,07 %) cao và có
tiềm năng tiếp nhận gen GmGLP1 tốt nhất trong 4 giống đậu tương: ĐT22, ĐVN9,
ĐT26 và DT84 đã được sử dụng trong nghiên cứu.
2. Trong 4 giống đậu tương nghiên cứu: ĐT22, ĐVN9, ĐT26 và DT84 đã tạo
được cây chuyển gen mang gen GmGLP1 của 3 giống đậu tương: ĐT22, ĐT26 và
DT84. Dựa vào kết quả phân tích PCR ở cây chuyển gen thế hệ T0, thu được tần suất biến nạp của các giống đậu tương như sau ĐT22: 0,93%; ĐT26: 0,27% và DT84: 0,13%.
3. Phân tích đánh giá sự ổn định di truyền của giống đậu tương ĐT22 ở thế hệ T1 bằng phương pháp phun Basta và phương pháp phân tích Southern blot. KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục nghiên cứu và tìm ra dịng thuần của giống đậu tương ĐT22
mang gen GmGLP1.
2. Đánh giá khả năng kháng hạn và sự ổn định di truyền của dòng đậu tương
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Trần Văn Điền (2007), Giáo trình cây Đậu tương, NXB Nơng Nghiệp, Hà
Nội.
2. Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Mai Hương, Nguyễn Hữu Kiên (2012)“Nghiên
cứu quy trình biến nạp gen vào giống đậu tương ĐT22 thông qua Agrobacterium
tumefaciens”, Tạp chí khoa học và cơng nghệ Việt Nam, 9 (39), tr. 119 – 124.
3. Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Anh Vũ, Nguyễn Hữu Kiên, Dương Tuấn Bảo (2013), “Nghiên cứu biến nạp gen liên quan đến khả năng kháng hạn và kháng
thuốc trừ cỏ vào giống đậu tương ĐT22”,Tạp chí khoa học và cơng nghệ Việt Nam,
11, tr. 3 – 9.
4. Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Phú Hùng, Lê Thị Thanh
Hương (2005), "Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh hóa và nhân gen dehydrin của
một số giống đậu tương địa phương vùng núi phía bắc Việt Nam", Báo cáo khoa
học Hội nghị toàn quốc – Nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Đại học Y Hà Nội, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội
5. Trần Thị Cúc Hòa (2007) “Nghiên cứu khả năng đáp ứng chuyển nạp gen
của các giống đậu tương trồng ở Việt Nam”, Tạp chí nơng nghiệp và phát triển
nông thôn, 18, tr. 9 – 14.
6. Nguyễn Huy Hoàng (1992) “Nghiên cứu khả năng chịu hạn của các giống
đậu tương nhập nội ở miền Bắc Việt Nam”, Luận án phó tiến sỹ, Hà Nội.
7. Chu Hoàng Mậu (2001) “Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để
rao các dịng đậu tương và đậu xanh thích hợp cho miền núi Đông bắc việt nam”
Luận án tiến sỹ sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà nội.
8. Tổng cục thống kê (2013), Niên giám thống kê 2012, NXB Thống kê, Hà Nội.
Tài liệu tiếng Anh
9. Akwatulira F., Gwali S., Okullo J.B.L., Ssegawa P., Tumwebaze S. B., Mbwambo J. R., Muchugi A. (2001), “Influence of rooting media and indole-3-
butyric acid (IBA) concentration on rooting and shoot formation of Warburgia
ugandensis stem cuttings”, African Journal of Plant Science, 5(8), pp. 421-429.
10. Banerjee J, Maiti M. K. (2010), “Functional role of rice germin-like protein1
in regulation of plant height and disease resistance”,Biochemical and Biophysical
Research Communications, 394(1), pp. 178-183.
11. Bartels D., Sunkar R. (2005), “Drought and Salt Tolerance in Plants”,Critical
Reviews in Plant Sciences,24(1), pp. 23-58.
12. Birch R.G. (1997), “ Plant Transformation: Problems and Strategies for
Practical Application”, Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular
Biology, 48, pp. 297-326.
13. Boyer J.S. (1982), “Plant productivity and environment”, Science,
218(4571), pp. 443–448.
14. Chaves M.M., Costa J.M., Saibo N.J.M. (2011), “Recent Advances in
Photosynthesis Under Drought and Salinity”, Advances in Botanical Research, 57,
pp. 50-83.
15. Chee, P. P., Fober K. A., Slightom J. L. (1989), “Transformation of Soybean
(Glycine max)by Infecting Germinating Seeds with Agrobacterium tumefaciens”,
Plant Physiology,91(3), pp. 1212-1218.
16. Chen M., Wang Q. Y., Cheng X. G., Xu Z. S., Li L. C., Ye X. G., Xia L. Q.,
Ma Y. Z. (2007), “GmDREB2, a soybean DRE-binding transcription factor, conferred drought and high-salt tolerance in transgenic plants”, Biochemical and
Biophysical Research Communiction,353(2), pp.299-305.
17. Chen W. S., Chiu C. C., Liu H. Y., Lee T. L., Cheng J. T., Lin C. C., Wu Y. J., Chang H. Y. (1998), “Gen transfer via pollen-tube pathway for anti-fusarium wilt
in watermelon”,Biochemistry and Molecular Biology International,46(6), pp. 1201-
18. Chowrira, G. M., Akella V., Lurquin, P.F. (1995), “Electroporation-mediated gen transfer into intact nodal meristems in planta. Genrating transgenic plants
without in vitro tissue culture”,Molecular Biotechnology,3(1), pp. 17-23.
19. Christou P., Murphy J. E., Swain W. F. (1987), “Stable transformation of soybean by electroporation and root formation from transformed
callus”,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America, 84(12), pp. 3962-3966.
20. Chumakov M.I., Rozhok N. A., Velikov V.A., Tyrnov V.S., Volokhina I.V.
(2006), “Agrobacterium-mediated in Planta Transformation of Maize via Pistil Filaments”,Russian Journal of Gentics,42(8), pp. 893-897.
21. Cleene M. D., Ley J. D. (1976), “The host range of crown gall”,Botanical
Review, 42(4), pp. 389-466.
22. Cook E.R., Seager R., Cane M.A., Stahle D.W. (2007), “North American
drought: reconstructions, causes, and consequences”,Earth-Science Reviews, 81, pp.
93-134.
23. de Ronde J. A., Laurie R. N., Caetano T., Grayling M. M., Kerepesi I.(2004), “Comparative study between transgenic and non-transgenic soybean lines proved
transgenic lines to be more drought tolerant”, Euphytica, 138, pp.123-132.
24. Delauney A. J.,Verma D. P.(1990), “A soybean gen encoding delta 1- pyrroline-5-carboxylate reductase was isolated by functional complementation in
Escherichia coli and is found to be osmoregulated”,Molecular &Genral Gentics,221(3), pp. 299-305.
25. Delzer B. W., Somer D.A., Orf J.H. (1990), “Agrobacterium tumefaciens
susceptibility and plant regenration of 10 soybean genotypes in maturity group 00 to
II”, Crop Science, 30(2), pp. 320-322.
26. Di R., Purcell V., Collins G.B., Ghabrial S.A. (1996), “Production of transgenic soybean lines expressing the bean pod mottle virus coat protein precursor
27. Doyle J.J., Doyle J.L. (1987), “A rapid DNA isolation procedure for small
quantities of fresh leaf tissues”, Phytochemical Bulletin,19, pp. 11-15.
28. Duan X. L., Chen S. B. (1985), “Variation occurring by introduction of the
exogenous DNA into rice”. Scientia Sinica. Series B, Chemical, biological,
agricultural, medical & earth sciences / Chung-kuo k'o hsüeh yüan, chu pan, 18,
pp. 6-10.
29. Farooq M., Wahid A., Kobayashi N., Fujita D., Basra S.M.A. (2009),“Plant
drought stress: effects, mechanisms anh management”,Agronomy for Sustainable
Development,29(1), pp. 185-212.
30. Fromm M., Taylor L.P., Walbot V. (1985), “Expression of gen transferred
into monocot and dicot plant cells by electroporation”,Proceeding of the National
Academy of Sciences of the United States of America,82(17), pp. 5824-5828.
31. Hadi M. Z., McMullen M.D., Finer, J.J. (1996), “Transformation of 12
different plasmids into soybean via particle bombardment”,Plant Cell Reports,15,
pp. 500-505.
32. Hansen G., Das A., Chilton M.D. (1994), “Constitutive expression of the
virulence gens improves the efficiency of plant transformation by Agrobacterium”,
Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America,91(16), pp. 7603-7607.
33. Hood E. E., Helmer G. L., Fraley R. T., Chilton M. D. (1986), “The
hypervirulence of Agrobacterium tumefaciensA281 is encoded in a region of pTiBo542 outsite of T-DNA”, Journal of Bacteriology, 168(3), pp.1291-1301.
34. Hooykaas P.J. J., Schilperoort R.A. (1992), “Agrobacterium and plant gentic engineering”, Plant Molecular Biology,19, pp.15-38.
35. Hooykaas P.J.J., Beijersbergen A. G. M. (1994), “The virulence system of
Agrobacterium tumefaciens”,Annual Reviewof Phytopathology, 32, pp. 157-179.
36. Hu C. Y., Wang L. (1999), “In planta soybean transformation technologies
developed in China: Procedure, comfirmation and field performance”, In Vitro Cell
37. Hymowitz T., Newell C. A. (1981), “Taxonomy of the Genus Glycine Domestication and Uses of Soybeans”, Economic Botany, 35(3), pp.272-288.
38. Ingram J., Bartels D., (1996),“The molecular basis of dehydration tolerance
in plants”, Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology,47, pp.
377-403.
39. Jorgensen R.A., Cluster P.D., English J., Que Q., Napoli C.A (1996), “Chalcone synthase cosuppression phenotype in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences”,
Plant Molecular Biology, 31(5), pp. 957-973.
40. Ke Y., Han G., He H., Li J. (2009), “Differential regulation of proteins and
phosphoproteins in rice under drought stress.” Biochemical and biophysical
research communications, 379 (1), pp. 133 – 138.
41. Knecht K., Seyffarth M., Desel C., Thurau T., Sherameti I., Lou B., Oelmullier
R., Cal D. (2010), “Expression of BvGLP-1 Encoding a Germin-Like Protein from Sugar Beet in Arabidopsis thaliana Leads to Resistance Against Phytopathogenic Fungi”,Molecular Plant-Microbe interaction, 23(4), pp. 446-457.
42. Lata C., Prasad M. (2011), “Role of DREBs in regulation of abiotic stress
responses in plants”,Journal of Experimental Botany, 62(14), pp. 4731-4748.
43. Li Z., Nelson R.L., Widholm J.M., Bent A. (2002), “Soybean
Transformation via the Pollen Tube Pathway”, Soybean Gentics Newsletter, 29, pp. 1-11.
44. Liu DP, Yuan Y, and Sun H (1992), “A study of exogenous DNA introduction into cultivated soybean. In: Zhou GY, Chen SB, and Hu JQ (eds),
Advances in Molecular Breeding Research of Agriculture”, China Agri Sci Tech
Press, pp. 134 – 140.
45. Lu M, Han Y., Gao J., Wang X., Li W. (2010), “Identification and analysis of
46. McCabe D. E., Swain W.F., Martinell B. J., Christou, P. (1988), “Stable
transformation of soybean (Glycine max Merrill) by particle acceleration”,
Bio/Technology, 6,pp. 923-926.
47. Mello-Farias, P. C., Chaves, A. L. S. (2008), “Advances in Agrobacterium– mediated plant transformation with Emphasis on soybean”, Sci Agric (piracicaba,
Braz), 65(1), pp. 95-106.
48. Meurer C. A., Dinkins R. D., Collins G. B. (1998), “Factors affecting
soybean cotyledonary node transformation”, Plant Cell Reports, 18(3-4), pp. 180-
186.
49. Nguyen HT, Babu RCBlum, A. (1997) “Breeding for drought resistance in rice: physiology and molecular gentics considerations:, Crop Sci, 37, 1426 – 1434.
50. Ni W. C., Zhang Z. L., Guo S. D. (1998), “Development of transgenic insect-
resistant cotton plants”,Scientia Sinica. Series B, Chemical, biological, agricultural,
medical & earth sciences / Chung-kuo k'o hsüeh yüan, chu pan,31, pp. 8-13.
51. Olhoft P. M., Flagel L. E., Donovan C. M., Somers D. A.(2003),“Efficient soybean transformation using hygromycin B selection in the cotyledonary-node
method”,Planta, 216(5), pp. 723-735.
52. Olhoft P. M., Lin K., Galbraith J., Nielsen N. C., Somers D. A. (2001), “The
role of thiol compounds in increasing Agrobacterium-mediated transformation of soybean cotyledonary-node cells”, Plant Cell Reports,20, 731-737.
53. Olhoft P. M., Somers D. A. (2001), “L-Cysteine increases Agrobacterium- mediated T-DNA delivery into soybean cotyledonary-nodes cells”, Plant Cell
Reports, 20(8), 706-711.
54. Parrott W. A., Hoffman L. M., Hildebrand D.F., Williams E. G., Collin G.B.
(1989), “Recovery of primary transformants of soybean”, Plant Cell Reports, 7(8),
pp. 201-204.
55. Paz M.M., Huixia S., Zibiao G., Zhanyuan Z., Anjan K. B. and Wang K.
transformation using the cotyledonary node explant” , Euphytica, 136, pp: 167 –
169.
56. Paz, M. M., Guo H., Zhang Z., Banerjee Z., Wang A. K., Kan
(2004),“Assessment of conditions affecting Agrobacterium-mediated soybean transformation using the cotyledonary node explant”,Euphytica 136, pp. 167-179.
57. Paz, M. M., Martinez, J. C., Kalvig A. B., Fonger T. M., Wang K. (2006),
“Improved cotyledonary node method using an alternative explant derived from
mature seed for efficient Agrobacterium-mediated soybean transformation”, Plant
Cell Reports, 25(3), pp. 206-213.
58. PazM. M., Martinez J. C., Kalviq A. B., Fonger T. M., Wang K. (2006), “Improve cotyledonary node method using an alternative explant derived from
mature seed for efficient Agrobacterium-mediated soybean transformation”, Plant
Cell Reports, 25(3), pp. 206-213.
59. Pederson, H.C., Christiansen, J., Wyndaele, R. (1983), “Induction and in
vitro culture of soybean crown gall tumors”,Plant Cell Reports, 2(24), pp. 201-204.
60. Perl A., Lotan O., Abu-Abied M., Holland D. (1996), “Establishment of an
Agrobacterium–mediated transformation system for grape (Vitis vinifera L.): the
role of antioxidants during grape–Agrobacterium interactions”. Nature Biotechnology,14(5), pp. 624-628.
61. Ramanjulu S., Bartels D., (2002),“Drought- and desiccation-induced
modulation of gen expression in plants”, Plant cell& Environment, 25(2), pp.141-
151.
62. Rietz S., Bernsdorff F. E. M., Cai D. (2012),“Members of the germin-like protein family in Brassica napus are candidates for the initiation of an oxidative
burst that impedes pathogensis of Sclerotinia sclerotiorum”, Journal of
experimental botany, 63(15), pp. 5507-5519.
63. Salinger M.J., Sivakumar M.V.K., Motha R. (2005),“Reducing vulnerability of agriculture and forestry to climate variability and change: workshop summary
64. Sambrook, J., Russell, D. (2001) Molecular Cloning, 3rd edition. Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor.
65. Santarem E.A., Pelissier B., Fimer, J.J. (1997), “Effect of explant orientation, pH, solidifying agent and wounding on initiation of soybean somatic embryos”,
Invitro Cellular and Development Biology – Plant, 33(1), pp. 13-19.
66. Schmidt M. A., Lafayette P. R., Artelt B. A., Parrott W. A. (2008), “A comparison of strategies for transformation with multiple gens via microprojectile-
mediated bombardment”,In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant, 44,
pp. 162-168.
67. Shou H., Palmer R. G., Wang K. (2002), “Irreproducibility of the Soybean
Pollen-Tube Pathway Transformation Procedure”, Plant Molecular Biology
Reporter,20, pp. 325-334.
68. Somerville C., Briscoe J., (2001),“Gentic Engineering and Water”, Science,
292 (5525), pp. 2217.
69. Southern E.M. (1975),“Detection of specific sequences among DNA
fragments separated by gel electrophoresis”, Journal of Molecular Biology, 98(3),
pp. 503-517.
70. Stachel S.E., Messens E., Montagu M.V., Zambryski P. (1985), “Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells which
activate the T-DNA transfer process in Agrobacterium tumefaciens”, Nature, 318,
pp. 624-629.
71. Tinland B., Hohn B., (1995), “Recombination between prokaryotic and
eukaryotic DNA: integration of Agrobacterium tumefaciens T-DNA into the plant genome”, Gentic Engineering, 17, pp. 209-229.
72. Tran Thi Cuc Hoa (2008),“Efficiency of developing transgenic soybean from the varieties MTĐ 176, HL 202, Maverick and Williams 82 by cotyledonary-node
method using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation”, Science &
73. Trejgell A., Chernetskyy M., Podlasiak J., Tretyn A. (2013), “An efficient
system for regenrating Taraxacum pieninicum Pawl. from seedling explants”,Acta
Biologica Cracoviensia. Series Botanica, 55(1), pp. 73-79.
74. Trick H.N., Finer J.J. (1997), “SAAT: sonication-assisted Agrobacterium- mediated transformation”, Transgenic Research, pp. 329-337.
75. Versulues P.E., Agarwal M., Katiyar-Agarwal S., Zhu J., Zhu J.K. (2006) “Methods and concepts in quantifying resistance to drought, salt and freezing,
abiotic stresses that affect plant water status”,The Plant Journal for cell and
molecular biology, ;45(4), pp. 523-539.
76. Wery J., Silim S.N., Knights E.J., Malhotra R.S., CousinR.(1994),:Screening techniques and sources of tolerance to extremes of moisture and air temperature in
cool season food legumes”,Euphytica,73(1-2), pp. 73-83.
77. Xue R., Xie H., Zhang B. (2006), “A multi-needle-assisted transformation of