Nhân dòng gen mã hóa helicase và xây dựng cây phát sinh loài

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.13. Nhân dòng gen mã hóa helicase và xây dựng cây phát sinh loài

Để xác định nguồn gốc tiến hóa của BQCV lưu hành tại Việt Nam, chúng tôi

tiến hành xây dựng cây phát sinh lồi dựa trên trình tự gen mã hóa Helicase của

BQCV.

Thiết kế mồi: Trên cơ sở trình tự hệ gen BQCV đã công bố trên Ngân hàng gen thế giới và trình tự hệ gen của BQCV gây bệnh trên ong mật Việt Nam, chúng

tôi thiết kế cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại vùng gen mã hóa Helicase của BQCV.

Cặp mồi có trình tự như sau:

Trình tự nucleotide Trình tự nucleotide Độ dài sản phẩm khuếch đại BQCV-helF 5’-GGTGTTAGCTATATGCGACACC-3’ 1710-1731 729bp BQCV-helR 5’-TCCTTCCTGGAAGTACATGGC -3’ 2418-2438

Thực hiện phản ứng PCR: Thực hiện phản ứng PCR với các mẫu dương tính với BQCV sử dụng cặp mồi đã thiết kế ở trên.

Bảng 2.8. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn DNA mã hóa helicase

Bước tổng hợp Nhiệt độ (oC) Thời gian

Bước 1 95C 3 phút

Bước 2 95C 30 giây

Bước 3 58C 30 giây

Bước 4 72C 1 phút

Bước 5 Lặp lại 35 chu kì từ bước 2 đến bước 4

Bước 6 72C 7 phút

Bước 7 4C ∞

- Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra tren gel agarose 1%.

- Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự DNA bằng máy xác định trình tự tự động ABI 3100.

Sản phẩm sau phản ứng PCR được tiến hành tinh sạch theo GenJETTMPCR Purification Kit của Fermentas:

 Bước 1: Thêm 5 lần thể tích buffer 1 vào sản phẩm PCR, trộn đều

 Bước 2: Chuyển dịch vào cột gắn DNA và ly tâm 13000 vòng/phút, 1 phút

 Bước 3: Loại dịch phía dưới cột gắn

 Bước 4: Thêm 500 µl buffer 2 vào cột và ly tâm 13000 vòng/phút, trong 1 phút

 Bước 5: Loại dịch phía dưới cột

 Bước 6: Lặp lại bước 4 và bước 5

 Bước 7: Làm khô bằng cách ly tâm tiếp một lần nữa ở 13000 vòng/phút, trong 1 phút

 Bước 8: Thêm 30 µl nước vào cột và ly tâm 13000 vòng/phút, trong 1 phút

 Bước 9: Chuyển dịch sau ly tâm sang ống eppendoff mới và bảo quản sản phẩm sau tinh sạch để tiến hành giải trình tự.

Xây dựng cây phát sinh loài: Cây phát sinh loài được xây dựng trên cơ sở

trình tự gen mã hóa Helicase từ BQCV trong nghiên cứu này cùng với các trình tự gen mã hóa Helicase của BQCV đã được cơng bố trên Ngân hàng gen, bao gồm: 2

trình tự từ BQCV gây bệnh trên ong mật ở Balan, 2 trình tự từ Hungary, 2 trình tự từ Áo và 5 trình tự từ Hàn Quốc. Các phần mềm xây dựng cây phát sinh lồi mà chúng tơi sử dụng ở đây là Bioedit (version 7.2) và MEGA (version 6.1) với hệ số boostrap lặp lại 1000 lần.