BQCV từ các mẫu ong ở miền Bắc Việt Nam.
M : Thang DNA 1kb (Fermantas), 1-8: T265BĐB - T272BĐB, 9-15: T273BHY –T279BHY
Kết quả điện di cho thấy có một số mẫu (giếng 2 và giếng 8 hình 3.1) xuất hiện băng có kích thước ~700 bp, phù hợp với kích thước theo tính tốn lý thuyết của đoạn DNA đặc hiệu BQCV là 701 bp. Có thể kết luận các mẫu này dương tính với BQCV. Tuy nhiên, ở tất cả các mẫu đều xuất hiện một băng DNA nhỏ có kích thước khoảng 100 bp khơng đặc hiệu. Đây có thể là do lượng mồi dư thừa, hoặc là sản phẩm dimer của primer. Để khẳng định chắc chắn sản phẩm RT-PCR với kích thước khoảng 700 bp chính là trình tự DNA đặc hiệu cho BQCV, chúng tôi tiến hành tách dịng gen sản phẩm RT-PCR và giải trình tự DNA để phân tích, so sánh với trình tự DNA của BQCV đã được công bố trên Genbank bằng chương trình BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
250b pp 500bp 750bp
3.1.3. Tách dòng sản phẩm RT-PCR đoạn DNA đặc hiệu BQCV
3.1.3.1. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến
Sản phẩm PCR đoạn DNA đặc hiệu BQCV được gắn trực tiếp vào vector tách
dịng pCR2.1 nhờ enzyme T4-ligase, sau đó biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng
DH5α bằng kỹ thuật sốc nhiệt. Q trình được tiến hành như mơ tả ở trên. Sau khi biến nạp, dịch tế bào đem cấy trải lên đĩa petri chứa môi trường LB đặc bổ sung Amp, X- gal và nuôi ở điều kiện 37o
C qua đêm. Với môi trường chọn lọc này, chỉ có các tế bào mang vector pCR2.1 có gen kháng kháng sinh Amp mới sống sót và phát triển thành các khuẩn lạc. Chúng tôi thu được rất nhiều khuẩn lạc, gồm các khuẩn lạc màu xanh và khuẩn lạc màu trắng (kết quả khơng trình bày ở đây). Các khuẩn lạc mang vector
pCR2.1 gốc (khơng gắn sản phẩm PCR mà tự đóng vịng) sẽ có màu xanh do gen LacZ
khơng bị phá vỡ cấu trúc gen nên hoạt động bình thường và tổng hợp được enzyme β- galactosidase. Enzyme này thủy phân cơ chất X- gal thành một sản phẩm có khả năng kết hợp với oxi để tạo thành chất có màu xanh da trời có tên 5,5 dibrom-4,4 dichloro indigo. Trong khi đó các khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp sẽ có màu trắng do sản
phẩm PCR chèn vào cấu trúc gen LacZ, phá hủy cấu trúc của gen này dẫn đến không
tổng hợp được β-galactosidase.
3.1.3.2. Kết quả tách chiết plasmid
Để chọn lọc vector pCR2.1 mang sản phẩm PCR đoạn DNA đặc hiệu BQCV, chúng tôi nhặt nuôi ngẫu nhiên 4 khuẩn lạc màu trắng và 1 khuẩn lạc màu xanh làm đối chứng, rồi tiến hành tách chiết plasmid. Q trình tách chiết plasmid được mơ tả ở mục phương pháp nghiên cứu. Plasmid sau đó điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả điện di được thể hiện ở (hình 3.2).
Hình 3.2. Kết quả tách chiết plasmid từ các khuẩn lạc màu trắng và khuẩn lạc màu xanh.
Đường chạy 1-4: Plasmid được tách chiết từ các khuẩn lạc màu trắng từ 1-4 Đường chạy ĐC: Plasmid được tách chiết từ khuẩn lạc màu xanh
Hình ảnh điện di cho thấy plasmid tách chiết từ các khuẩn lạc màu trắng (đường chạy số 1- 4) đều có kích thước lớn hơn so với plasmid được tách chiết từ khuẩn lạc xanh (đường chạy DC). Như ta đã biết, trong quá trình điện di, phân tử DNA có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn phân tử DNA có kích thước nhỏ hơn. Do đó, nhiều khả năng plasmid tách chiết từ các khuẩn lạc trắng mang đoạn DNA ngoại lai nên kích thước lớn hơn, di chuyển chậm hơn so với plasmid tách chiết từ khuẩn lạc xanh (không mang đoạn DNA ngoại lai). Để chắc chắn cho giả
thuyết đó, chúng tơi tiến hành chọn 2 plamid ở trên để cắt kiểm tra với EcoRI.
3.1.3.3. Kết quả cắt kiểm tra plasmid bằng enzyme giới hạn EcoRI
Do vector tách dịng pCR2.1 có hai vị trí cắt của EcoRI ở hai đầu của vùng cắt
gắn đa vị (vị trí gắn của DNA ngoại lai), nên nếu các dịng plasmid có gắn sản
phẩm PCR thì sau khi xử lý bằng enzyme giới hạn EcoRI sẽ văng ra một đoạn DNA
có chiều dài tương đương với chiều dài của sản phẩm PCR gắn vào và một băng có
kích thước bằng kích thước của vector PCR2.1. Phản ứng cắt bằng EcoRI được mô
tả như ở trên. Sản phẩm phản ứng cắt được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả cắt được thể hiện ở (hình 3.3).