CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.8. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn E coli
Biến nạp: Là quá trình đưa DNA tinh sạch vào một tế bào vi khuẩn. Một tế bào có khả năng tiếp nhận DNA được gọi là tế bào khả biến. Có rất nhiều phương pháp biến nạp như: Hóa biến nạp (đối với vi khuẩn nhờ sốc nhiệt), điện biến nạp (đối với nấm men). … Tính khả biến có thể được cảm ứng trong E. coli nhờ xử lý bằng dung dịch CaCl2. Xử lý này tạo các cổng mở nhất thời trong thành tế bào tạo khả
năng cho các DNA di chuyển vào tế bào chủ.
* Tạo tế bào khả biến
- Tế bào E. coli được nuôi qua đêm trong 5ml môi trường LB lỏng.
- Pha lỗng huyền dịch tế bào đã ni cấy theo tỉ lệ 1:100 trong 5ml môi trường LB. - Nuôi lắc ở 37oC, 200 vòng/phút (v/p), sau 2 giờ kiểm tra mật độ tế bào, giá trị OD600 đạt 0,6 - 1 là đạt yêu cầu.
- Chuyển dịch tế bào sang ống falcon vô trùng, để trên đá trong 30 phút. - Ly tâm thu sinh khối ở 4oC, tốc độ 5.000 v/p trong 10 phút;
- Rửa cặn tế bào bằng 1/2 thể tích CaCl2 100mM ở 4oC. Lặp lại 2 lần.
- Hòa cặn tế bào thành huyền dịch trong 1/20 CaCl2 100mM, chia ra mỗi ống epd 100µl giữ trong đá ít nhất 1 giờ trước khi biến nạp, các ống còn lại được giữ trong - 80oC.
* Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến
Plasmid tái tổ hợp được đưa vào tế bào khả biến bằng kỹ thuật sốc nhiệt do Mandel và Hinga phát hiện năm 1970. Các bước tiến hành như sau:
- Bổ sung 10 µl plasmid tái tổ hợp vào ống tế bào khả biến, sau đó cắm trên đá 30 phút.
- Sốc nhiệt ở 42oC trong 1 phút 30 giây, sau đó cắm ngay lên đá để 2 phút.
- Bổ sung 250 µl mơi trường LB lỏng, lắc tốc độ 200v/p, 37oC, trong 1 giờ.
- Cấy trải trên mơi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh amp và X- gal, IPTG với nồng độ 100µg/ml.
- Ni ở 37oC, qua đêm [44].