CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN PHÁT HIỆN VIRU SỞ ONG MẬT
Chẩn đốn bệnh đã có những bước tiến rất lớn, đặc biệt từ khi phát triển các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại. Hiện nay có rất nhiều các cơng nghệ và các cơng cụ có sẵn để phát hiện, định lượng chính xác protein và tự nucleotide của các tác nhân gây bệnh như virus, vi khuẩn, ký sinh trùng… Các kỹ thuật hiện đại cho phép phát hiện những biến đổi dù rất nhỏ (thay đổi 1 hoặc 1 vài nucleotide) trong trình tự DNA của tác nhân gây bệnh. Các phương pháp chẩn đoán cổ điển phát hiện bệnh bao gồm xác định triệu chứng biểu hiện bệnh, quan sát dưới kính hiển vi, xét nghiệm sinh học và phương pháp huyết thanh học. Mỗi phương pháp có điểm mạnh và điểm yếu riêng nên cần lựa chọn công nghệ phù hợp nhất với yêu cầu chẩn đoán của từng tác nhân gây bệnh. Với sự phát triển của khoa học nói chung và sinh học phân tử hiện đại nói riêng, các kỹ thuật chẩn đốn phát hiện hiện đại hiện nay có thể phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm, với độ nhạy và độ chính xác cao, tiện lợi và đơn giản trong sử dụng [16].
1.4.1. Phương pháp ELISA (xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) ELISA chữ viết tắt của cụm từ Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay. Đây ELISA chữ viết tắt của cụm từ Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay. Đây là kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất để xác định kháng thể (KT) đặc hiệu chống virus ở thời điểm xuất hiện triệu trứng hay ngay sau khi xuất hiện triệu chứng. Kỹ thuật này cho phép xác định KT ở nồng độ rất thấp (khoảng 0,1ng/ml). Nguyên lý của phương pháp này là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể (KN -KT). KT được đánh dấu bằng cách gắn với enzyme, khi thêm cơ chất thích hợp enzyme sẽ phân giải cơ chất cho sản phẩm có màu. ELISA giúp xác định sự có mặt hay
khơng có mặt cũng như lượng KN trong mẫu nghiên cứu [10].
- Ưu điểm: Ưu điểm quan trọng nhất của kỹ thuật này là độ nhạy cao, có thể phát hiện được phức hợp KN – KT ở nồng độ thấp; thao tác nhanh, đơn giản, ít tốn kém. - Nhược điểm: Độ đặc hiệu khơng cao và địi hỏi độ tinh sạch của mẫu lớn.
1.4.2. Phương pháp phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR)
PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction, được Kary Mullis và các cộng sự phát triển vào năm 1983. Đây được xem là một trong những phát minh có tính chất đột phá lớn nhất của lĩnh vực sinh học phân tử và công nghệ sinh học hiện đai [7].
Hiện nay, PCR là một kỹ thuật phổ biến nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản
sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E. coli hay nấm
men. PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đốn những bệnh nhiễm trùng, tách dịng gene, và xác định huyết thống.
Nguyên tắc của PCR là dựa trên cơ sở tính chất biến tính và hồi tính của DNA và nguyên lý tổng hợp DNA.Trên cơ sở trình tự của đoạn DNA khuôn, đoạn mồi, nucleotid tự do và enzyme DNA polymerase có thể tổng hợp được DNA giới hạn bởi các đoạn mồi. Một phản ứng PCR gồm nhiều sản phẩm ở các chu kỳ trước lại làm khn cho các chu kỳ tiếp theo, vì vậy số lượng bản sao tạo ra theo cấp số nhân. Một phản ứng PCR thường thực hiện từ 20 – 40 chu kỳ nên từ 1 bản DNA khn ban đầu có thể tạo 220 – 240 bản sao DNA [2].
- Ưu điểm: Thời gian thực hiện nhanh, chỉ cần 3 giờ là có thể khuếch đại được một trình tự DNA đích. Thực hiện đơn giản và ít tốn kém (nó được thực hiện trong ống nghiệm plastic nhỏ gồm thành phần tối thiểu được thực hiện đồng thời). Độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
- Nhược điểm: Cần phải có DNA mồi đặc trưng cho DNA cần khuếch đại. Để có đoạn mồi này ít nhất phải biết trước trình tự nucleotide cần khuếch đại. Kích thước
DNA cần khuếch đại không vượt quá 3kb. Khả năng ngoại nhiễm lớn (do thao tác nhiều lần). Sai sót trong phản ứng còn do sử dụng Enzyme -Taq-polymerase (khoảng 10-4 sai sót cho một lần sao chép).
1.4.3. Phương pháp RT – PCR
- RT – PCR (Reverse transcriptase polymerase chain rection) là kỹ thuật PCR cải tiến từ kỹ thuật PCR chuẩn, được sử dụng để nhân các đoạn DNA từ mạch khuôn RNA. Thực chất kỹ thuật RT – PCR gồm 2 giai đoạn: Giai đoạn đoạn phiên mã ngược từ mạch khuôn RNA tạo cDNA và giai đoạn khuếch đại đoạn cDNA bằng cặp mồi đặc hiệu. RT – PCR thường được sử dụng để tạo ra thư viện cDNA lớn từ một lượng rất nhỏ mRNA; sử dụng trong việc nhận biết các đột biến đa hình dựa vào trình tự phiên mã ngược và được sử dụng trong việc định lượng mức độ biểu hiện của gen. Ngồi ra, RT – PCR cịn có một ứng dụng quan trọng nữa đó là chúng được sử dụng trong việc chẩn đoán các bệnh do virus RNA.
- Nguyên tắc của phản ứng RT – PCR
Về nguyên tắc, bước đầu tiên của phản ứng RT-PCR là quá trình phiên mã ngược từ phiên mẫu mRNA để tạo ra sợi đơn cDNA. Trong kỹ thuật RT – PCR có sự tham gia của hai loại enzyme là enzyme phiên mã ngược (reversetranscriptase ) và DNA polymerase. Một primer oligodeoxynucleotide sẽ gắn vào mRNA và sau đó chúng sẽ được kéo dài nhờ một enzyme phiên mã ngược có hoạt tính polymerase để tạo thành bản sao cDNA. Bản sao này sau đó sẽ được khuếch đại nhờ vào phản ứng PCR ở bước thứ hai. Tùy theo mục đích của xét nghiệm, primer sử dụng để tạo cDNA đầu tiên có thể được thiết kế đặc hiệu để lai vào một vị trí xác định trên mRNA hay có thể được thiết kế để gắn vào nhiều vị trí trên mRNA.[5]. Hiện nay, RT – PCR là một trong những phương pháp phổ biến nhất được sử dụng để phát hiện virus gây bệnh trên ong mật.
1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CHẨN ĐOÁN VIRUS GÂY BỆNH TRÊN ONG VIỆT NAM
Ở Việt Nam, nghề ni ong đã được hình thành từ rất lâu, tuy nhiên những nghiên cứu về virus gây bệnh trên ong vẫn còn rất hạn chế, có rất ít cơng trình được
cơng bố. Trước đây, việc phát hiện sự có mặt virus thường dựa vào những phương pháp truyền thống như kính hiển vi điện tử, huyết thanh học hay miễn dịch học…. Các phương pháp này có những hạn chế như tốn nhiều thời gian và độ đặc hiệu thấp dẫn đến xác định sai virus liên quan. Ngày nay, kỹ thuật được sử dụng phổ biến để phát hiện các bệnh do virus hại trên thực vật và động vật nói chung và đối với bệnh do virus gây hại trên ong mật nói riêng là kỹ thuật RT - PCR. Năm 2004, lần đầu tiên Lê Thanh Hòa và cộng sự đã giám định virus gây bệnh trên ong bằng phương pháp sinh học phân tử tại các trại ong ở Hịa bình, Hải Hưng [4]. Tại Trung tâm nghiên cứu ong TW, Lê Quang Trung và cộng sự (2008) đã bước đầu ứng dụng kỹ thuật multiplex RT-PCR/RFLP để phát hiện virus trên đàn ong nội tại Hịa Bình. Phạm Hồng Thái và cộng sự (2011) đã sử dụng kỹ thuật RT- PCR để phát hiện SBV và DWV trên ong mật nuôi tại Hà Nội [8]. Trương Anh Tuấn và cộng sự (2012) đã sử dụng kỹ thuật RT – PCR nghiên cứu mức độ nhiễm 6 chủng virus phổ biển và gây hại nghiêm trọng cho ong mật nuôi tại Việt Nam [9]. Mặc dù vậy, các nghiên cứu mới chỉ tiến hành trên quy mơ nhỏ nên cần thiết phải có những nghiên cứu ở quy mơ tồn quốc về dịch tễ học phân tử của các virus gây bệnh trên ong, về đặc điểm phân tử hệ gen của các virus gây bệnh. Đồng thời chúng ta cũng cần phát triển được các phương pháp chẩn đốn có thể đồng thời phát hiện được nhiều loại virus trên cùng một phản ứng với độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn. Các kết quả nghiên cứu đó sẽ làm cơ sở để dự báo và đưa ra các biện pháp phòng trừ hiệu quả các bệnh do virus gây ra trên ong mật đang được nuôi và khai thác ở nước ta.
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỊA ĐIỂM THU MẪU
- Các mẫu ong mật được thu thập tại 5 tỉnh miền Bắc Việt Nam, bao gồm: Hưng n, Điện Biên, Hịa Bình, Bắc Giang, Nghệ An.
- Các thí nghiệm được tiến hành tại Phòng Vi sinh học phân tử -Viện công nghệ sinh học, Viện hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.
2.2. VẬT LIỆU VÀ HĨA CHẤT 2.2.1. Vật liệu 2.2.1. Vật liệu
Vật liệu là các mẫu ấu trùng và ong trưởng thành được thu thập từ các trại nuôi ong ở 5 tỉnh miền Bắc Việt Nam ở trên.
2.2.2. Hóa chất và sinh phẩm
Sinh phẩm
Bộ sinh phẩm SuperSciptTMFirst-StrDNA Synthsis System (Invitrogen) để tổng hợp cDNA, bộ sinh phẩm TA cloning Kit do hãng Invitrogen cung cấp để tách dòng gen, bộ sinh phẩm do hãng Fermentas cung cấp sử dụng để tinh sạch vector tái tổ hợp, bộ sinh phẩm GenJETTMPCR Purification Kit (Fermentas) để tinh sạch sản phẩm PCR, vector tách dòng pCR2.1, bộ sinh phẩm BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) dùng để giải trình tự gen.
Hóa chất
EDTA (Ethylendiamin tetraacetic acid), SDS (Sodium dodecyl sulphat), Trizol (phenol, pH=8, guanidinium thiocyanate, glycerol, sodium acetate), Chloroform, Iso amylalcohol, Phenol, Acetat natri, Acetat kali, Ethanol, NaCl, Tris-HCL, Tris base, Acid acetic, NaOH, Agarose, EtBr, Glycerol, Bromophen-l Blue, X-gal, Kháng sinh Ampicilin, TAE (Tris; acid acetic-Ethylendiamin tetraacetic acid)... dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử của các hãng uy tín như Sigma, Merck, Invitrogen…
Dung dịch dùng cho điện di DNA
- Dung dịch đệm điện di gốc TAE 50X có thành phần như sau:
Tris base 120 g
Acetic acid 28,6 ml
EDTA 0,5M pH 8,0 50 ml
Nước khử ion vừa đủ 500
- Đệm tra mẫu DNA (Loading buffer) 5X:
Tris-HCL 1M pH 8,0 1ml EDTA 0,5M pH 8,0 0,2ml Glycerol 2ml Bromphenol Blue 1% 2ml H2O 4,8ml 2.2.3. Trang thiết bị
- Lị vi sóng (Sanyo, Nhật Bản), máy lắc ổn nhiệt 37oC, máy khuấy từ (RotoLab, OSI), tủ lạnh sâu -20oC, -75oC (Sanyo, Nhật Bản), máy khuấy trộn Vortex
(RotoLab, OSI), máy quang phổ nanoDrop (Thermosciencis), máy soi chụp ảnh gel
(Bio-Rad), cân phân tích 10-4 (Mettler Toledo), bộ nguồn điện di (Bio-Rad), tủ cấy vô trùng (Sanyo), pipetman các loại (Gilson), nồi khử trùng (Nhật bản), cân điện 10-
2
g (Mettler Toledo), máy ly tâm lạnh (Sorvall Biouge Fresco), máy PCR, máy xác định trình tự DNA tự động (ABI 3100, Applied Biosystems, Mỹ).
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Để xác định sự lây nhiệm của BQCV trên ong mật (Apis cerana và Apis
mellifera) ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam, chúng tôi tiến hành theo sơ đồ nghiên
Hình 2.1. Sơ đồ mô tả các bước thực hiện trong nghiên cứu Thu thập mẫu ong ấu trùng và trưởng thành Thu thập mẫu ong ấu trùng và trưởng thành
Tách chiết RNA tổng số
Xác định nồng độ RNA bằng máy quang phổ
Tổng hợp cDNA từ RNA tổng số
Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu BQCV
Điện di kiểm tra trên gel Agarose 1%
Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn Ecoli
Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng PCR2.1
Tách chiết DNA plasmid
Chọn dòng plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn EcoRI
Tinh sạch plasmid tái tổ hợp
Xác định trình tự đoạn DNA đặc hiệu của BQCV
2.3.1. Phương pháp thu mẫu
Ấu trùng ong, ong trưởng thành được thu thập từ các trại nuôi ong ở 5 tỉnh miền Bắc. Mỗi tỉnh thu mẫu ở 6 trại, mỗi trại thu 3 đàn khác nhau, mỗi đàn thu 100 ấu trùng và 100 ong trưởng thành. Hai trại thu mẫu cách nhau ít nhất là 10 km. Mẫu được ký hiệu bằng các chữ cái như ong trưởng thành ký hiệu là T và ấu trùng ký hiệu là A, chữ số kèm theo được đánh theo thứ tự thu thập mẫu như sau: Hưng Yên, Điện Biên, Hịa Bình, Bắc Giang, Nghệ An... Sau đó mẫu được bảo quản trong Ethanol 100% và giữ ở -20oC cho đến khi sử dụng.
2.3.2. Phương pháp tách chiết RNA tổng số
Mỗi đàn ong lấy ngẫu nhiên 10 cá thể ấu trùng và 10 cá thể ong trưởng
thành. Tách chiết RNA tổng số được thực hiện theo các bước sau [44]:
Khử trùng dụng cụ nghiền mẫu
Rửa mẫu ấu trùng và ong trưởng thành bằng DEPC
Nghiền mẫu bằng N2 lỏng, bổ sung thêm nước đã xử lý Rnase
Bổ sung 500µl Trizol, mix đều
Ly tâm 12000 v/p ở 40C trong 2 phút
Loại bỏ cặn, bổ sung Cloroform: isoamyl (24:1) theo tỉ lệ 1:1 với dịch mẫu
Ly tâm 12000 v/p ở 40C trong 30 phút
Hút dịch nổi và bổ sung Isopropanol với tỉ lệ 1:1
Tủa ở nhiệt độ phòng trong 5 phút
Ly tâm 12000 v/p ở 40C trong 30 phút để thu tủa RNA
Rửa tủa lại bằng 1 ml Ethanol 70%
Ly tâm 12000 v/p trong 15 phút ở 40C
Làm khô RNA trong box
Hòa lại cặn RNA trong 30 l nước vô trùng đã loại RNase
Xác định độ tinh sạch và nồng độ RNA trong các mẫu RNA tổng số bằng máy quang phổ nanodrop.
2.3.3. Xác định nồng độ RNA bằng máy quang phổ nanodrop
Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base purin va pyrimidine. Mức độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm (A260) của mẫu cho phép xác định nồng độ DNA trong mẫu. Độ hấp thụ này còn phụ thuộc vào các yếu tố như: PH, nhiệt độ, cường độ ion.... Độ hấp thụ tăng lên khi ở trong môi trường axit hoặc kiềm. Trong thí nghiệm RNA được pha lỗng trong dung mơi là nước và ở nhiệt độ phòng.
Một đơn vị OD của bước sóng 260nm kí hiệu A260 A260 = 1,0 = 50 µg/ml DNA sợi đơi
A260 = 1,0 = 37 µg/ml DNA sợi đơn A260 = 1,0 = 40 µg/ml RNA
Nồng độ DNA hay RNA được tính theo cơng thức sau : * Nồng độ DNA sợi đôi : CDNA = OD260 x 50 x d (µg/ml ) CDNA là nồng độ sợi đơi
d là độ pha lỗng mẫu
* Nồng độ RNA hay DNA sợi đơn : CDNA/RNA = OD260 x 40 x d CDNA/RNA là nồng độ DNA sợi đơn hay RNA
Tuy nhiên cách tính trên chỉ chính xác khi dung dịch acid nucleic sạch. Trong mẫu acid nucleic thường có lẫn các tạp chất. Những tạp chất này làm tăng độ hấp thụ ở bước sóng 280nm. Vì vậy để đánh giá mức độ tinh sạch của dung dịch người ta tính tỉ số OD260/OD280 = T
Nếu T< 1,8 thì chứng tỏ dung dịch acid nucleic có lẫn tạp chất. Nếu 1,8< T < 2,0 thì dung dịch acid nucleic đó được coi là sạch. 2.3.4. Tổng hợp cDNA từ RNA tổng số
RNA tổng số được dùng làm khuôn để tổng hợp cDNA bằng cách sử dụng hệ thống enzym phiên mã ngược như khuyến cáo của nhà sản xuất (Invitrogen). Enzym được sử dụng trong phản ứng này là Reverse transcriptase với cặp mồi ngẫu nhiên để tạo cDNA. Các thao tác thực hiện như sau:
Bảng 2.1.Thành phần phản ứng của hỗn hợp A
Thành phần Thể tích (µl)
RNA tổng số (30ng–50ng) 7
Mồi ngẫu nhiên (50 ng/µl) 3
Tổng thể tích 10
- Hỗn hợp trên được trộn đều bằng pipet
- Ủ hỗn hợp trên 5 phút ở 65oC bằng máy PCR, sau đó đặt trên đá ít nhất 1 phút +) Chuẩn bị hỗn hợp B với các thành phần phản ứng như (bảng 2.2).
Bảng 2.2.Thành phần phản ứng của hỗn hợp B Thành phần Thể tích (µl) Thành phần Thể tích (µl) 5X RT Buffer(0,5M Tris-HCl pH-8,3; 0,75M KCl; 0,03M MgCl2) 4 (10 mM) dNTP mix 2 (0,1mM) DTT 2
Inibitor Rnase (20 u/µl) 1
Reverse trancriptase (20 u/µl) 1
Tổng thể tích 10
- Bổ sung 10µl hỗn hợp ở ống B vào ống A để thực hiện phản ứng tổng hợp cDNA. - Chu trình nhiệt phản ứng tổng hợp cDNA từ RNA tổng số trong máy PCR được thực hiện như (bảng 2.3).
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt cho phản ứng tổng hợp cDNA
Nhiệt độ (oC) Thời gian
25oC 5 phút
42oC 60 phút
70oC 5 phút
2.3.5. Khuếch đại đoạn DNA đặc hiệu cho BQCV từ cDNA bằng phản ứng PCR
- Mẫu cDNA được sử dụng làm khuôn tổng hợp đoạn DNA đặc hiệu (701 bp) của