Thành phần Thể tích (µl)
H2O 5,5
10X Buffer cho E.coRI 1
EcoRI 0,5
Plasmid tái tổ hợp 3
Tổng thể tích 10
Hỗn hợp phản ứng được trộn đều, ủ ở nhiệt độ 37oC trong 2 giờ. Sản phẩm phản ứng cắt được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%.
2.3.11. Tinh sạch plasmid tái tổ hợp
Kít tinh sạch được cung cấp bởi hãng Fermentas
- Bổ sung 100µl Binding Buffer vào 100µl plasmid, trộn đều. - Bổ sung tiếp 100µl isopropanol 100% vào hỗn hợp trên, trộn đều.
- Chuyển 300µl hỗn hợp trên lên cột A/B, ly tâm với tốc độ 10.000 v/p. Loại dịch ở cột B .
- Bổ sung dung dịch Wash buffer 100µl lên cột, ly tâm 10.000v/p. - Đổ hết phần dịch, ly tâm tiếp 12.000v/p.
- Chuyển cột A sang cột B mới.
- Bổ sung 50 µl nước giữ ở nhiệt độ phòng 10 phút để thu plasmid. - Điện di kiểm tra sản phẩm tinh sạch trên gel agarose 1%.
2.3.12. Giải trình tự gen bằng máy xác định trình tự tự động ABI 3100
Trình tự nucleotide của đoạn DNA đặc hiệu BQCV được xác định theo phương pháp của Sanger trên máy xác định trình tự DNA tự động ABI prism 3100 Sequencer (Applied Biosystems) với bộ Kit xác định trình tự BigDye® Terminater v3.1 Cycle Sequencing Kit của hãng Applied Biosystems. Quy trình xác định trình tự được tiến hành theo các bước:
- Thực hiện phản ứng tổng hợp với các thành phần như (bảng 2.7) Bảng 2.7.Thành phần phản ứng giải trình tự gen
H2O vơ trùng 5.725 µl
Big dye 3 µl
Dung dịch đệm 3 µl
Mồi (mồi xuôi và mồi ngược) 1.275 µl
Plasmide 2 µl Tổng 15 µl Chu trình nhiệt: Bước 1: 94oC 3 phút Bước 2: 94 oC 40 giây Bước 3: 56 oC 40 giây Bước 4: 72 oC 1 phút 20 giây
Bước 5: Lặp lại 25 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4
Bước 6: 72oC 8 phút
Bước 7: 4 oC ∞
- Sau đó chúng tơi tiến hành tinh sạch sản phẩm để xác định trình tự. Quy trình tinh sạch như sau:
Bổ sung 5µl EDTA 125mM pH = 8 vào mỗi ống sản phẩm
Thêm 60µl ethanol 100%
Ly tâm 4500 vòng/phút, 45 phút
Thu tủa, rửa cặn bằng 60µl ethanol 70%, hút dịch khoảng 5-7µl
Ly tâm 10000 vòng/phút, 10 phút
Loại dịch, thu cặn
Làm khô DNA bằng máy speedvac
Thêm 15µl hydroformasmide
Biến tính 3 phút ở 95oC
Đưa mẫu vào máy xác định trình tự tự động ABI 3100
2.3.13. Nhân dịng gen mã hóa helicase và xây dựng cây phát sinh lồi
Để xác định nguồn gốc tiến hóa của BQCV lưu hành tại Việt Nam, chúng tôi
tiến hành xây dựng cây phát sinh lồi dựa trên trình tự gen mã hóa Helicase của
BQCV.
Thiết kế mồi: Trên cơ sở trình tự hệ gen BQCV đã công bố trên Ngân hàng gen thế giới và trình tự hệ gen của BQCV gây bệnh trên ong mật Việt Nam, chúng
tôi thiết kế cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại vùng gen mã hóa Helicase của BQCV.
Cặp mồi có trình tự như sau:
Trình tự nucleotide Trình tự nucleotide Độ dài sản phẩm khuếch đại BQCV-helF 5’-GGTGTTAGCTATATGCGACACC-3’ 1710-1731 729bp BQCV-helR 5’-TCCTTCCTGGAAGTACATGGC -3’ 2418-2438
Thực hiện phản ứng PCR: Thực hiện phản ứng PCR với các mẫu dương tính với BQCV sử dụng cặp mồi đã thiết kế ở trên.
Bảng 2.8. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn DNA mã hóa helicase
Bước tổng hợp Nhiệt độ (oC) Thời gian
Bước 1 95C 3 phút
Bước 2 95C 30 giây
Bước 3 58C 30 giây
Bước 4 72C 1 phút
Bước 5 Lặp lại 35 chu kì từ bước 2 đến bước 4
Bước 6 72C 7 phút
Bước 7 4C ∞
- Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra tren gel agarose 1%.
- Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự DNA bằng máy xác định trình tự tự động ABI 3100.
Sản phẩm sau phản ứng PCR được tiến hành tinh sạch theo GenJETTMPCR Purification Kit của Fermentas:
Bước 1: Thêm 5 lần thể tích buffer 1 vào sản phẩm PCR, trộn đều
Bước 2: Chuyển dịch vào cột gắn DNA và ly tâm 13000 vòng/phút, 1 phút
Bước 3: Loại dịch phía dưới cột gắn
Bước 4: Thêm 500 µl buffer 2 vào cột và ly tâm 13000 vòng/phút, trong 1 phút
Bước 5: Loại dịch phía dưới cột
Bước 6: Lặp lại bước 4 và bước 5
Bước 7: Làm khô bằng cách ly tâm tiếp một lần nữa ở 13000 vòng/phút, trong 1 phút
Bước 8: Thêm 30 µl nước vào cột và ly tâm 13000 vòng/phút, trong 1 phút
Bước 9: Chuyển dịch sau ly tâm sang ống eppendoff mới và bảo quản sản phẩm sau tinh sạch để tiến hành giải trình tự.
Xây dựng cây phát sinh loài: Cây phát sinh loài được xây dựng trên cơ sở
trình tự gen mã hóa Helicase từ BQCV trong nghiên cứu này cùng với các trình tự gen mã hóa Helicase của BQCV đã được cơng bố trên Ngân hàng gen, bao gồm: 2
trình tự từ BQCV gây bệnh trên ong mật ở Balan, 2 trình tự từ Hungary, 2 trình tự từ Áo và 5 trình tự từ Hàn Quốc. Các phần mềm xây dựng cây phát sinh lồi mà chúng tơi sử dụng ở đây là Bioedit (version 7.2) và MEGA (version 6.1) với hệ số boostrap lặp lại 1000 lần.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. PHÁT HIỆN SỰ LÂY NHIỄM BQCV TRÊN ONG MẬT Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM VIỆT NAM
3.1.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số
Trong nghiên cứu này, các mẫu ong mật thu thập được từ các trại nuôi ong ở 5 tỉnh miền Bắc Việt Nam (Điện Biên, Hưng n, Hịa Bình, Bắc Giang, Nghệ An) được kí hiệu từ A255 và T255 theo thứ tự tăng dần đến A344 và T344 (A: là mẫu ấu trùng, T: là mẫu trưởng thành). Mỗi tỉnh gồm 6 trại, mỗi trại gồm 3 đàn bao gồm cả ấu trùng và ong trưởng thành. Như vậy chúng tôi thu được tổng số 90 đàn với 180 mẫu. Trong quá trình tiến hành thí nghiệm, từ mỗi đàn tiến hành chọn ngẫu nhiên 10 cá thể ấu trùng (làm thành 1 mẫu) và 10 cá thể ong trưởng thành (làm thành 1 mẫu) để tách chiết RNA tổng số. Sau khi tách 180 mẫu RNA tổng số, để biết được nồng độ cũng như độ tinh sạch của các mẫu RNA cho các nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi dùng phương pháp quang phổ kế xác định độ hấp phụ ở bước sóng 260 nm (A260) và 280 nm (A280) bằng máy nanodrop. Kết quả được trình bày ở (phụ lục 1).
Kết quả phân tích cho thấy, nồng độ và độ tinh sạch của tất cả các mẫu RNA sau tách chiết đều đáp ứng được yêu cầu cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2. Phát hiện BQCV bằng kỹ thuật RT-PCR
Tính đến thời điểm hiện tại, có nhiều phương pháp được dùng để xác định sự có mặt của BQCV ở ong như sử dụng kính hiển vi điện tử, khuếch tán miễn dịch, ELISA và RT-PCR. Trong đó phương pháp RT-PCR được xem là một phương pháp phát hiện trực tiếp, nhanh và nhạy nhất. Chính vì vậy sau khi tách chiết RNA tổng số, chúng tôi tiến hành phân tích sự có có mặt của BQCV trên 180 mẫu ong mật (bao gồm cả mẫu ong trưởng thành và ấu trùng) thu thập từ các trại nuôi ong ở các tỉnh miền Bắc bằng kỹ thuật RT - PCR. Trên cơ sở tham khảo các cơng trình đã cơng bố và trình tự hệ gen của BQCV trên Ngân hàng gen quốc tế (Genbank), chúng tôi thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho BQCV.
Theo thiết kế, sản phẩm phản ứng RT-PCR thu được có kích thước là 701 bp. Q trình được thực hiện như mơ tả ở phần phương pháp nghiên cứu. Sản phẩm của phản ứng RT-PCR sau đó được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả điện di phân tích của một số mẫu đại diện được trình bày ở (hình 3.1). Các mẫu cho kết quả dương tính là mẫu xuất hiện băng DNA có kích thước ~700 bp.
Hình 3.1. Kết quả điện di trên gel agarose xác định các mẫu dương tính với BQCV từ các mẫu ong ở miền Bắc Việt Nam. BQCV từ các mẫu ong ở miền Bắc Việt Nam.
M : Thang DNA 1kb (Fermantas), 1-8: T265BĐB - T272BĐB, 9-15: T273BHY –T279BHY
Kết quả điện di cho thấy có một số mẫu (giếng 2 và giếng 8 hình 3.1) xuất hiện băng có kích thước ~700 bp, phù hợp với kích thước theo tính tốn lý thuyết của đoạn DNA đặc hiệu BQCV là 701 bp. Có thể kết luận các mẫu này dương tính với BQCV. Tuy nhiên, ở tất cả các mẫu đều xuất hiện một băng DNA nhỏ có kích thước khoảng 100 bp khơng đặc hiệu. Đây có thể là do lượng mồi dư thừa, hoặc là sản phẩm dimer của primer. Để khẳng định chắc chắn sản phẩm RT-PCR với kích thước khoảng 700 bp chính là trình tự DNA đặc hiệu cho BQCV, chúng tơi tiến hành tách dịng gen sản phẩm RT-PCR và giải trình tự DNA để phân tích, so sánh với trình tự DNA của BQCV đã được công bố trên Genbank bằng chương trình BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
250b pp 500bp 750bp
3.1.3. Tách dòng sản phẩm RT-PCR đoạn DNA đặc hiệu BQCV
3.1.3.1. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến
Sản phẩm PCR đoạn DNA đặc hiệu BQCV được gắn trực tiếp vào vector tách
dòng pCR2.1 nhờ enzyme T4-ligase, sau đó biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng
DH5α bằng kỹ thuật sốc nhiệt. Quá trình được tiến hành như mô tả ở trên. Sau khi biến nạp, dịch tế bào đem cấy trải lên đĩa petri chứa môi trường LB đặc bổ sung Amp, X- gal và nuôi ở điều kiện 37o
C qua đêm. Với mơi trường chọn lọc này, chỉ có các tế bào mang vector pCR2.1 có gen kháng kháng sinh Amp mới sống sót và phát triển thành các khuẩn lạc. Chúng tôi thu được rất nhiều khuẩn lạc, gồm các khuẩn lạc màu xanh và khuẩn lạc màu trắng (kết quả khơng trình bày ở đây). Các khuẩn lạc mang vector
pCR2.1 gốc (không gắn sản phẩm PCR mà tự đóng vịng) sẽ có màu xanh do gen LacZ
không bị phá vỡ cấu trúc gen nên hoạt động bình thường và tổng hợp được enzyme β- galactosidase. Enzyme này thủy phân cơ chất X- gal thành một sản phẩm có khả năng kết hợp với oxi để tạo thành chất có màu xanh da trời có tên 5,5 dibrom-4,4 dichloro indigo. Trong khi đó các khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp sẽ có màu trắng do sản
phẩm PCR chèn vào cấu trúc gen LacZ, phá hủy cấu trúc của gen này dẫn đến không
tổng hợp được β-galactosidase.
3.1.3.2. Kết quả tách chiết plasmid
Để chọn lọc vector pCR2.1 mang sản phẩm PCR đoạn DNA đặc hiệu BQCV, chúng tôi nhặt nuôi ngẫu nhiên 4 khuẩn lạc màu trắng và 1 khuẩn lạc màu xanh làm đối chứng, rồi tiến hành tách chiết plasmid. Quá trình tách chiết plasmid được mô tả ở mục phương pháp nghiên cứu. Plasmid sau đó điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả điện di được thể hiện ở (hình 3.2).
Hình 3.2. Kết quả tách chiết plasmid từ các khuẩn lạc màu trắng và khuẩn lạc màu xanh.
Đường chạy 1-4: Plasmid được tách chiết từ các khuẩn lạc màu trắng từ 1-4 Đường chạy ĐC: Plasmid được tách chiết từ khuẩn lạc màu xanh
Hình ảnh điện di cho thấy plasmid tách chiết từ các khuẩn lạc màu trắng (đường chạy số 1- 4) đều có kích thước lớn hơn so với plasmid được tách chiết từ khuẩn lạc xanh (đường chạy DC). Như ta đã biết, trong quá trình điện di, phân tử DNA có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn phân tử DNA có kích thước nhỏ hơn. Do đó, nhiều khả năng plasmid tách chiết từ các khuẩn lạc trắng mang đoạn DNA ngoại lai nên kích thước lớn hơn, di chuyển chậm hơn so với plasmid tách chiết từ khuẩn lạc xanh (không mang đoạn DNA ngoại lai). Để chắc chắn cho giả
thuyết đó, chúng tơi tiến hành chọn 2 plamid ở trên để cắt kiểm tra với EcoRI.
3.1.3.3. Kết quả cắt kiểm tra plasmid bằng enzyme giới hạn EcoRI
Do vector tách dịng pCR2.1 có hai vị trí cắt của EcoRI ở hai đầu của vùng cắt
gắn đa vị (vị trí gắn của DNA ngoại lai), nên nếu các dòng plasmid có gắn sản
phẩm PCR thì sau khi xử lý bằng enzyme giới hạn EcoRI sẽ văng ra một đoạn DNA
có chiều dài tương đương với chiều dài của sản phẩm PCR gắn vào và một băng có
kích thước bằng kích thước của vector PCR2.1. Phản ứng cắt bằng EcoRI được mô
tả như ở trên. Sản phẩm phản ứng cắt được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả cắt được thể hiện ở (hình 3.3).
Hình 3.3. Kết quả điện di trên gel agarose 1% sản phẩm cắt plasmid
tái tổ hợp bằng EcoRI.
M: Marker DNA 1kb, 1-2: sản phẩm cắt plasmid từ 2 khuẩn lạc màu trắng số 1, 2.
Kết quả phân tích bằng enzyme giới hạn cho thấy, cả 2 dòng plasmid được
chọn sau khi cắt bằng EcoRI đều văng ra đoạn DNA có kích thước bằng với kích
thước đoạn DNA đặc hiệu BQCV theo thiết kế (~700 bp). Từ đó có thể khẳng định chúng tơi đã chọn được 2 dòng plasmid tái tổ hợp mang đoạn DNA đặc hiệu BQCV. Plasmid mang DNA ngoại lai này sẽ được tinh sạch, giải trình tự và so sánh với trình tự DNA của BQCV.
3.1.4. Kết quả giải trình tự đoạn DNA đặc hiệu BQCV
Phản ứng giải trình tự DNA được tiến hành trên máy xác định trình tự DNA tự động ABI prism 3100 Sequencer (Applied Biosystems) với bộ kit xác định trình tự BigDye® Terminater v3.1 Cycle Sequencing Kit của hãng Applied Biosystems. Trình tự DNA thu được được phân tích bằng các phần mềm tin sinh chuyên dụng. Đoạn DNA ngoại lai được tách dịng trong vector pCR2.1 có kích thước là 701 nucleotide, nhưng trong quá trình đọc trình tự DNA tự động, một số trình tự nucleotide của DNA ngoại lai có tín hiệu bị nhiễu, do đó sau xử lý chúng tôi thu được trình tự đoạn DNA dài 698 nucleotide (Hình 3.4).
M 1 2
Total count, all bases: 698, Adenine (A) count: 176, Thymine (T) count: 219, Guanine (G) count: 159, Cytosine (C) count: 144, %G~C content: 43,4%
1 TGGTCAGCTC CCACTACCTT AAACATAGTG GCGGAGATGT ATGCGCTTTA TCGAGGAGGA 61 GTTCGAGTTA AAGTTGTTAC TGAGAAGGGT GTGGATTTCG TCAGAGCTAC CGTTAGTCCT 121 CAACAGACTT ATGGTAGTGA TGTCGCACCT ACTACTCATA TCAGTACTCC TTTGGCAATA 181 GAACAAATAC CTATAAAGGG AGTCGCAGAG TTCCAAATAC CGTACTATGC TCCATGTTTG 241 TCATCTTCGT TTAGAGCGAA TTCGGAAACA TTTTACTATA GTTCAGGTCG GAATAATCTC 301 GATATAGCCA CTTCACCTCC ATCCATCAAT CGCTATTATG CGGTAGGTGC GGGAGATGAT 361 ATGGACTTTT CCATCTTTAT CGGTACGCCG CCCTGTATTC ATGCTTCTCA GACGGCCCAG 421 TTTACCAAAA TAAAACAAGG TAAAGTGTAT GATTTGAGGT ATGATCAGTA TGACCCTTTC 481 AGGGAAGTCC AGGACGGTAC GGCGTTCCTC AATGCTCGTA GTATTGAGGA TAGCGATTTG 541 TTGTGAGCTC CTTTAGAGGG AGGGCTCACT TTATCTATTG CTTAAATCGG TAAGCCACAA 601 ACTTTTCTAA GTGTCATGAG TTTCTTCTCG GTTCTTCTCA TGACTACTAA TCGAACCGTG 661 TGTAGAGTCA GAATGTTGTG GTTTACGTTT CTTCTTGT
Hình 3.4. Trình tự đoạn DNA ngoại lai gắn trong vector pCR2.1 tái tổ hợp Tiếp theo chúng tôi sử dụng phần mềm BLAST để so sánh đoạn trình tự thu Tiếp theo chúng tơi sử dụng phần mềm BLAST để so sánh đoạn trình tự thu được với trình tự gen của BQCV đã được cơng bố trên Genbank. Kết quả so sánh được thể hiện ở (bảng 3.1) và (hình 3.5).
Bảng 3.1. Kết quả so sánh trình tự nuclotide đoạn DNA tách dịng với các trình tự gen của BQCV trên Genbank
Mã số Tên Độ tương đồng lớn nhất Tổng độ tương đồng Độ bao phủ Sai số Độ tương đồng JN185928.1 BQCV được phân lập dựa trên vùng protien cấu trúc LP1
1267 1267 100% 0.0 99%
JN185930.1 BQCV được phân lập dựa trên vùng protien cấu trúc LP3
1262 1262 100% 0.0 99%
JX149531 BQCV được phân lập dựa trên vùng protien cấu trúc và protein không cấu trúc
EF517515
Chủng BQCV từ Huggary được phân lập dựa trên vùng protien cấu trúc và protein không cấu trúc
1068 1068 88% 0.0 98%
HQ6554721
Chủng BQCV AJL6-PA- USA-2007 được phân lập dựa trên vùng protein cấu trúc
1206 1206 100% 0.0 98%
AF183905
BQCV được phân lập dựa trên vùng protien cấu trúc và protein không cấu trúc
1201 1201 100% 0.0 98%
DQ364629.1
BQCV từ Uruguay được phân lập dựa trên vùng protien cấu trúc
1048 1048 91% 0.0 96%
Qua bảng so sánh ở trên ta thấy trình tự nucleotide của đoạn DNA ngoại lại mà chúng tơi thu được có độ tương đồng rất cao với các trình tự gen của BQCV đã được cơng bố trên Genbank, cụ thể là: Tương đồng 99% với trình tự DNA của BQCV phân lập từ Trung Quốc (mã số trên Genbank JN185928.1; JN185930.1) và Hàn Quốc (JX149531), 98% với BQVC từ Hungary (EF517515), Mỹ (HQ6554721) và Nam phi (AF183905), 96% với BQCV từ Uruguay (DQ364629.1). Ví dụ về sự bắt cặp trình tự nuclotide đoạn DNA ngoại lai chúng tôi thu được với trình tự nuclotide BQCV của Nam phi được thể hiện ở (hình 3.5).
Hình 3.5: Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn DNA đặc hiệu BQCV lưu hành ở Việt Nam với trình tự nucleotide của BQCV từ Nam Phi.