http://waynesword.palomar.edu/montph9.htm http://en.wikipedia.org/wiki/File:Taxol.svg
Paclitaxel (C47H51NO14 có khối lƣợng phân tử M = 853,906 g/mol) lần đầu tiên đƣợc đề xuất với tên gọi là Caltuvocus – cây Thủy tùng – từ thời La Mã cổ đại. Một số bài thuốc dân gian cũng sử dụng các dịch chiết này nhƣ một chất độc hoặc thuốc chữa bệnh.Nghiên cứu độc tính của Paclitaxel lên tế bào bắt đầu từ năm 1962, và đến năm 1967, thành công trong việc tách chiết chất này từ vỏ cây Thông đỏ (Taxus brevifolia), đặt tên là Taxol.Tuy nhiên đến năm 1979, cơ chế tác dụng của Taxol mới đƣợc khám phá. Horwits và cộng sự đã công bố các phát hiện của họ về tƣơng tác giữa Paclitaxel với các vi ống, đó là khả năng thúc đẩy quá trình hình thành vi ống bằng cách bám và làm bền vi ống, ngăn sự giải trùng hợp sợi vô sắc ở kỳ sau, và làm tế bào bị dừng lại ở kỳ giữa của nguyên phân. Tế bào sau đó đƣợc
bắt đầu từ năm 1984 và cho đến nay, Paclitaxel đang đƣợc sử dụng để điều trị ung thƣ phổi, ung thƣ buồng trứng, ung thƣ vú, ung thƣ chuyển dạng Kaposi sarcoma.
Với những hiệu quả Paclitaxel mang lại trên bệnh nhân ung thƣ, hiện nay ở Việt Nam, các nhà khoa học cũng đang tập trung nghiên cứu các phƣơng pháp chiết xuất hợp chất này từ cây Thơng đỏ. Tuy nhiên nguy cơ tuyệt chủng của lồi cây này đang đƣợc cảnh báo, vì vậy với sự phát triển của khoa học công nghệ, nhiều cơ quan, viện nghiên cứu đã phát triển các phƣơng pháp khác để sản xuất Taxol nhƣ nuôi cấy mô tế bào, hoặc từ nấm nội sinh thực vật, đồng thời phát triển dự án trồng cây Thông đỏ ở Việt Nam.
3.3.3. Chế phẩm Derrone
Chế phẩm Derrone do Viện Dƣợc Liệu bào chế và cung cấp, đạt tiêu chuẩn cơ sở, sử dụng cho Dƣợc lý thực nghiệm. Chế phẩm cung cấp có dạng tinh thể màu vàng nhạt, ngun chất.
Hình 9: Cây vơng nem Erythrina orientalis L. Murr và công thức cấu tạo Derrone
http://thaythuocvietnam.vn/Thuc-an-chua-chung-mat-ngu-t1204--n6896 http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Derrone.svg
Derrone có nguồn gốc từ cây Vơng nem. Lồi cây này còn đƣợc gọi bằng nhiều tên gọi khác là cây lá Vơng, Hải đồng bì, Thích đồng bì, với tên khoa học là
Erythrina orientalis L. Murr..Ngồi ra cịn có các tên đồng nghĩa khác nhƣ
Erythrina indica Lam., Erythrina variegata L. var orientalis (L.)Merr., Erythrina
variegata L. Lồi này phân bố rộng từ Ðơng Á tới châu Phi. Ở châu Á, loài này phổ biến ở Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Campuchia, Lào, Việt Nam, Malaysia,
Indonesia và Philippin. Vỏ, lá và rễ của cây Vông nem là một vị thuốc dân gian của Việt Nam cũng nhƣ nhiều nƣớc trên thế giới với nhiều tác dụng hiệu quả nhƣ an thần, chữa mất ngủ, hạ huyết áp, co bóp cơ, trừ phong thấp và kháng khuẩn.
Derrone (5,4-dihydroxy-7,8-(2,2-di- methylpyrano)isoflavone) có cơng thức hóa học là C20H16O5, M = 336,1 g/mol, lần đầu tiên đƣợc phân lập vào năm 1980, tuy nhiên những nghiên cứu về hợp chất này chƣa đƣợc quan tâm nhiều. Năm 2012, Hayet Edziri và cộng sự đã nghiên cứu và chứng minh tác động kháng khuẩn của Derrone. Theo nghiên cứu này, Derrone có khả năng kháng vi khuẩn chủng
Pseudomonasaeruginosa và Escherichia coli với nồng độ trong khoảng từ 7,81 –
15,62 µg/ml. Ngồi ra, Derrone cũng thể hiện tính kháng nấm mạnh với các loài thuộc họ Candida ở nồng độ 7,81 µg/mL. Đặc biệt, khi nghiên cứu trên tế bào động vật, Derrone cũng thể hiện độc tính với dịng ung thƣ gan Hep-G2 (IC50 = 30 µg/ml) và dòng tế bào ung thƣ vú KPL4 (IC50= 17,8 µg/ml) (R2>0,9)[1, 11]. Một nghiên cứu khác cho thấy, Derrone còn có tác dụng ức chế hoạt động của DGAT (diacylglycerol acyltransferase) với chỉ số IC50 là 15,1 µg/ml, ứng dụng trong điều trị tiểu đƣờng loại 2 [35]. Mặc dù vậy, cơ chế chuyên sâu về tác động của Derrone lên tế bào vẫn chƣa đƣợc biết rõ.
Chƣơng 2 – ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƢỢNG
- Các dòng tế bào ung thƣ HeLa, MCF-7, H1299 và dòng tế bào thận phơiHEK 293 do Nhóm nghiên cứu Ung thƣ học thực nghiệm – Bộ môn Sinh học Tế bào – Khoa Sinh học – Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội cung cấp (Bảng 3).
Bảng 3: Đặc điểm, nguồn gốc và điều kiện nuôi cấy của các dòng tế bào sử dụng trong nghiên cứu
Dòng tế bào HeLa MCF-7 H1299 HEK 293
Loại tế bào Ung thƣ cổ tử
cung Ung thƣ vú Ung thƣ phổi không tế bào nhỏ Tế bào phôi thận
Mô Biểu mô tuyến Biểu mô tuyến Biểu mô -
Nguồn gốc Ngƣời Ngƣời Ngƣời Ngƣời
Cách thức
sinh trƣởng Bám dính Bám dính Bám dính Bám dính
Biểu hiện
p53 +/- +/+ -/- +/+
Môi trƣờng
cơ bản DMEM RPMI DMEM DMEM
Môi trƣờng
nuôi cấy Môi trƣờng cơ bản + 10% FBS + 1% Peni/Strep
Môi trƣờng
- Chất 14 – Derrone do Nhóm nghiên cứu của TS. Phƣơng Thiện Thƣơng, Viện Dƣợc liệu Trung ƣơng cung cấp, tinh thể dạng bột màu vàng tinh nguyên chất.
- Đối chứng VX-680 dạng thƣơng phẩm.
- Đối chứng dƣơng Taxol, dạng thƣơng phẩm 30 mg/5 ml, tƣơng đƣơng 6mg/ml.
2.2. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ HĨA CHẤT
Máy móc, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu đƣợc trình bày ở Bảng 4.
Bảng 4: Máy móc và thiết bị sử dụng
Tên thiết bị Hãng sản xuất Nƣớc sản xuất
Hệ thống máy xCELLigence RTCA ACEA Biosciences Hoa Kỳ Kính hiển vi huỳnh quang Axio Plan 2 Carl Zeiss Đức Kính hiển vi laser quét LSM 510 Carl Zeiss Đức Kính hiển vi soi ngƣợc Axiovert 40
CFL
Carl Zeiss Đức
Máy ly tâm Universal 320 Hettich Đức
Microplate Reader Model 680 Bio – Rad Nhật Bản
Pipett aid Gibson Pháp
Tủ ấm 5% CO2 Shell Lab Hoa Kỳ
Tủ hood Esco Mỹ
Dụng cụ và vật tƣ tiêu hao sử dụng trong nghiên cứu đƣợc liệt kê ở Bảng 5.
Bảng 5: Dụng cụ và vật tƣ tiêu hao
Tên dụng cụ Hãng sản xuất Nƣớc sản xuất
Buồng đếm tế bào Malassez Pháp
Đĩa E-plate ACEA Biosciences Hoa Kỳ
Đĩa nuôi cấy đa giếng Corning Hoa Kỳ
Đĩa nuôi cấy tế bào 35, 100mm Corning Hoa Kỳ
Lame, lamelle Sail Brand Trung Quốc
Micro coverglass Matsunami Nhật Bản
Ống Cryo Corning Hoa Kỳ
Ống Falcon 15, 50 ml Corning Hoa Kỳ
Ống eppendorf 1,5 ml Corning Hoa Kỳ
Hóa chất sử dụng trong đề tài đƣợc liệt kê trong Bảng 6.
Bảng 6: Hóa chất sử dụng trong đề tài
Tên hóa chất Hãng sản xuất Nƣớc sản xuất
Alexa Flour® 488, 546 Invitrogen Hoa Kỳ
Anti – Aurora B Abcam Hoa Kỳ
Blue Trypan Gibco Hoa Kỳ
CellTiter 96® Non-Radioactive Cell
Proliferation Assay Promega Hoa Kỳ
DMEM© Gibco Hoa Kỳ
FBS Invitrogen Hoa Kỳ
Hoestch 33342 Invitrogen Hoa Kỳ
Paraformaldehyde Merck Đức
PBS Gibco Hoa Kỳ
Peniciline/Streptomicin Gibco Hoa Kỳ
Propidium Iodide Invitrogen Hoa Kỳ
Rab H3PS10 Abcam Hoa Kỳ
RPMI Gibco Hoa Kỳ
Taxol (Paclitaxel) Ebewe Pharma Australia
Triton X Merck Đức
Trypsin – EDTA Gibco Hoa Kỳ
VX-680 (Tozasertib) Bio Vision Hoa Kỳ
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Hoạt hố và ni cấy tế bào
- Tế bào đƣợc bảo quản trong Nitơ lỏng hoặc tủ -80oC, lấy ra đem rã đông bằng bể ổn nhiệt 37oC và đƣa ngay vào tủ vô trùng.
- Đƣa dung dịch chứa tế bào vào trong ống ly tâm đã có chứa 2ml mơi trƣờng nuôi cấy, ly tâm 1300 rpm trong 5 phút, bỏ dịch nổi, thu cặn tế bào.
- Hòa cặn tế bào trong 5 – 7ml môi trƣờng nuôi cấy thích hợp để tạo thành dạng dung dịch huyền phù tế bào rồi cho vào đĩa Petri và ủ trong tủ ấm 37oC, 5% CO2. Kiểm tra tế bào hàng ngày,khi tế bào chiếm 70 – 80% bề mặt đĩa, tiến hành cấy chuyển tế bào sang đĩa nuôi cấy mới.
- Thu tế bào từ đĩa nuôi cấy: loại bỏ môi trƣờng nuôi cấy và rửa tế bào bằng PBS. Sau đó ủ tế bào với dung dịch Trypsin 1X trong 5 phút ở 37o
CO2. Trung hịa Trypsin bằng cách pha lỗng với môi trƣờng nuôi cấy, hút dịch và đem ly tâm ở 1300 rpm trong 5 phút.
- Kiểm tra tỷ lệ sống chết của tế bào bằng cách nhuộm với thuốc nhuộm Blue Trypan tỷ lệ 1:1 trong 3 – 5 phút rồi đếm số lƣợng bằng buồng đếm tế bào. Nếu tỷ lệ chết < 10% tổng số tế bào thì tế bào đƣợc xem là đủ khỏe mạnh dùng để cấy chuyển tiếp tục hoặc dùng cho các mục đích thí nghiệm tiếp theo.
2.3.2. Đánh giá độc tính của chế phẩm Derrone bằng phƣơng pháp MTT
Đối tƣợng
- Dịng tế bào thận phơi HEK 293.
- Chế phẩm Derrone với dải nồng độ 80 – 40 – 20 – 10 – 5 μg/ml. - Đối chứng Taxol với dải nồng độ 30 – 3 – 0,3 – 0,03 và 0,003µg/ml.
Nguyên lý
Chúng tôi sử dụng bộ kit CellTiter 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay của hãng Promega (gọi tắt là phƣơng pháp MTT). Phƣơng pháp MTT (3- [4,5-dimethylthiazol-2]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) hiện nay đƣợc sử dụng rất phổ biến ở nhiều phịng thí nghiệm trên thế giới. Ngun tắc của phƣơng pháp này dựa vào sự khử hợp chất MTT màu vàng thành dạng tinh thể formazan màu tímtrong tế bào sống[32]. Nồng độ formazan hình thành đƣợc đo bằng máy quang phổ ở bƣớc sóng 500-600nm.Q trình khử xảy ra dƣới sự xúc tác của enzym trong ty thể trong tế bào sống, theo đó hàm lƣợng của chất tạo ra tỷ lệ thuận với số lƣợng tế bào sống tham gia phản ứng.
Phƣơng pháp MTT có ƣu điểm là độ nhạy và độ chính xác cao, các bƣớc thực hiện đơn giản, trong thời gian ngắn, do đó thƣờng sử dụng kiểm tra độc tính để sàng lọc thuốc với số lƣợng lớn, trên nhiều nồng độ thuốc khác nhau. Kết quả thu đƣợc cho ra giá trị IC50 (nồng độ thuốc mà tại đó tế bào bị ức chế tăng sinh 50%), từ đó đánh giá đƣợc độ độc của thuốc cần nghiên cứu.
Hình 10: Nguyên lý hoạt động (trái) và các bước cơ bản (phải) của phương pháp MTT
http://www.dojindo.eu.com/store/p/782-DURALiQ-MTT-Stable-Solution.aspx
Kit CellTiter 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay đƣợc cung cấp bởi Promega gồm hai dung dịch là dung dịch nhuộm (Dye Solution) và hỗn hợp dung dịch hòa tan/dừng phản ứng (Solubilization Solution/Stop Mix).
Quy trình thí nghiệm
- Nạp tế bào: tiến hành nạp tế bào vào trong các giếng của đĩa nuôi cấy 96 giếng (đƣợc bố trí nhƣHình 11) với nồng độ 8000 tế bào/180µl mơi trƣờng ni cấy, sau đó ủ trong 37oC, 5% CO2 cho tế bào ổn định trong 24 giờ trƣớc khi tiến hành thử thuốc.
- Ủ với thuốc thử: Do chế phẩm là chất khó tan dung môi nên chúng tôi tiến hành pha thuốc trong dung mơi có bổ sung DMSO sao cho nồng độ cuối cùng của DMSO trong mỗi giếng tế bào là 0,15%. Sau đó ủ tế bào ở mỗi giếng với 20µl thuốc thử đã pha. Gõ nhẹ vào thành đĩa cho thuốc phân bố đều rồi ủ trong 48 giờ ở trong tủ ấm 37oC, 5% CO2.
Hình 11: Bố trí thí nghiệm trên đĩa ni cấy 96 giếng
(M): Giếng được nạp môi trường nuôi cấy; (MT): Giếng nạp môi trường nuôi cấy và tế bào; (VH): Giếng nạp môi trường nuôi cấy, tế bào và dung môi pha mẫu dùng làm đối chứng.
- Hút bỏ 100μl môi trƣờng ở mỗi giếng và bổ sung vào 15μl dung dịch nhuộm. Gõ nhẹ đĩa và ủ trong 4 giờ ở 37oC. Ở bƣớc này, dung dịch cần đƣợc bọc kín để tránh ánh sáng.
- Bổ sung vào giếng 100μl hỗn hợp dung dịch hòa tan/dừng phản ứng, gõ nhẹ đĩa và ủ trong 1 giờ.
- Đo mật độ quang học của dung dịch trong giếng bằng máy Microplate Reader ở bƣớc sóng 540nm.
- Dựa vào giá trị mật độ quang học, ta xác định đƣợc % tỷ số tăng sinh (A) của tế bào, từ đó đánh giá đƣợc độ độc đối với tế bào của chế phẩm. A đƣợc tính theo cơng thức:
A(%) = VT
H x 100(1)
VH: giá trị trung bình của mật độ quang học ở các giếng thử với dung môi pha thuốc. T: giá trị trung bình của mật độ quang học ở các giếng thử với thuốc.
Nếu A = 50% có nghĩa là thuốc có tác dụng gây độc và làm chết 50% tế bào. Nồng độ thuốc mà tại đó giá trị A đạt 50% gọi là liều gây chết 50% tế bào, ký hiệu là IC50. Đây là giá trị để đánh giá độc tính của thuốc đối với tế bào. Phƣơng pháp tính tốn giá tri IC50 đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của bộ kit.
2.3.3. Thử độc tính của Derrone sử dụng phƣơng pháp xCELLigence
Nguyên lý
Trƣớc đây, việc đo khả năng tăng sinh hay sự chết của tế bào dƣới tác động của thuốc thử chỉ thể hiện đƣợc ở một thời điểm nhất định. Một công nghệ mới đã đƣợc phát triển do Roche Applied Science kết hợp với ACEA Biosciences, cho phép kiểm tra tế bào theo thời gian, sử dụng đĩa nuôi cấy tế bào chuyên dụng. Hệ thống máy xCELLigence có thể đo và định lƣợng khả năng bám đáy đĩa, sự sinh trƣởng, cũng nhƣ sự chết của tế bào, hay bất kỳ một sự thay đổi nào về tính chất, từ đó đƣa ra đồ thị biểu diễn chỉ số tế bào (CI – cell index) theo thời gian[45].
Hình 12: Các thành phần chính (trái) và ngun tắc hoạt động (phải) của hệ thống xCELLigence
Thiết bị trung tâm của hệ thống xCELLigence là mạng lƣới cảm biến điện gắn ở dƣới đáy của đĩa 96 giếng (E-plate 96). Việc đo điện trở của những điện cực cảm biến này cho phép phát hiện và theo dõi những thay đổi của tế bào trên điện cực đó. Khả năng sống, số lƣợng, hình thái và độ bám dính của tế bào, tất cả đều ảnh hƣởng đến điện trở của điện cực.Ngồi ra, giá trị điện trở cịn phụ thuộc vào
diện tích bám của tế bào lên điện cực.Số lƣợng tế bào càng lớn, tế bào bám càng khỏe, càng trải dài ra bề mặt đĩa thì giá trị điện trở càng cao.
Hệ thống máy xCELLigence đƣợc cung cấp bởi nhà sản xuất Roche Applied Science (Đức) và Biosciences (Hoa Kỳ), gồm có 4 thành phần chính là máy phân tích RTCA (RTCA Analyzer), RTCA SP Station, đĩa 96 giếng có cảm biến điện (E- plate 96) và một phần mềm (RTCA Control Unit) (Hình 12).
Các tín hiệu điện trở từ đĩa E-Plate 96 đƣợc truyền đến máy phân tích thơng qua thành phần RTCA SP Station. Tất cả các kết quả đo từ máy phân tích sẽ đƣợc phần mềm RTCA Control Unit điều khiển, đồng thời ghi lại, tính tốn và vẽ đồ thị một cách chi tiết và chính xác. Ngồi ra phần mềm này cịn có rất nhiều ứng dụng hữu ích khác nhƣ tính tốn chỉ số IC50 ở từng thời điểm độc lập hay thời gian nhân đôi của tế bào… Hệ thống máy xCELLigence là một phƣơng pháp hiện đại với độ nhạy, chính xác, tin cậy cao và rất dễ sử dụng, tình trạng tế bào ở từng thời điểm đƣợc theo dõi hoàn toàn tự động.Phƣơng pháp này có thể thực hiện đƣợc trong nhiều mục đích thí nghiệm khác nhau nhƣ xác định khả năng bám dính và lan rộng, thử độc tính hay khả năng gây apoptosis của chất, xác định tín hiệu thụ thể, thậm trí có thể thực hiện trên virus.
Các bước thực hiện
Trong nghiên cứu, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp xCELLigence để theo dõi sự tăng sinh của tế bào và thử độc tính của chất Derrone lên các dịng tế bào khác nhau, cụ thể gồm có MCF-7, H1299 và HeLa, với đối chứng là VX-680, từ đó tìm ra giá trịIC50. Chúng tơi tiến hành thí nghiệm theo các bƣớc của hệ thống máy xCELLigence nhƣ sau:
- Một đĩa RTCA Resistor Plate 96 với các thông số chuẩn đƣợc đƣa vào máy để kiểm tra tín hiệu và khả năng hoạt động của các thiết bị trong hệ thống. - Kiểm tra tín hiệu của đĩa E-Plate 96 bằng cách cho mơi trƣờng khơng có tế
bào vào đĩa và đo trong 15 phút. Đĩa có thể sử dụng đƣợc khi kết quả đo xấp xỉ giá trị 0.
- Đƣa tế bào HeLa vào giếng với mật độ 5000 tế bào/180μl môi trƣờng/giếng và để tế bào bám đĩa ổn định trong khoảng 24 giờ ở điều kiện 37o
C, 5% CO2. Thí nghiệm đƣợc thiết kế tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp thử độc tính bằng MTT, chỉ khác là ở phƣơng pháp này, đối chứng dƣơng chúng tôi sử dụng là VX-