2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.4. Miễn dịch huỳnh quang
Trong đề tài, chúng tôi thực hiện phƣơng pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang để xác định khả năng ảnh hƣởng của Derrone lên sự phosphoryl hóa H3 tại Ser10 với đối chứng là VX-680.
Nồng độ thuốc thử:
- Chế phẩm Derrone (Der): 10, 15 và 30 μg/ml. - VX-680: 0,196 μg/ml.
- Taxol: 0,3 μg/ml.
Dòng tế bào nghiên cứu: HeLa và MCF-7.
Quy trình thí nghiệm:
- Chuẩn bị 5 đĩa nuôi cấy tế bào 35mm, mỗi đĩa chứa 3 coverglass sạch, đã khử trùng. Đƣa tế bào vào đĩa với mật độ 600.000 tế bào/1,8ml môi trƣờng ni cấy, chia làm 5 mẫu thí nghiệm tƣơng ứng gồm:
ĐCDM Taxol 0,3 μg/ml Taxol 0,3 μg/ml + VX-680 0,093μg/ml Taxol 0,3 μg/ml + Der 15μg/ml Taxol 0,3 μg/ml + Der 30 μg/ml (*) Với dòng MCF-7, sử dụng một nồng độ Derrone là 10 μg/ml.
- Để tế bào bám xuống bề mặt coverglass và sinh trƣởng ổn định sau 24 giờ nuôi cấy ở tủ ấm 5% CO2, 37oC.
- Tiến hành ủ tế bào với Taxol 0,3 μg/ml trong 8 giờ. - Tiếp tục ủ tế bào với VX-680 và Derrone trong 15 giờ.
- Quan sát, chụp ảnh tế bào và bắt đầu tiến hành nhuộm miễn dịch huỳnh quang theo các bƣớc nhƣ sau:
Hút bỏ môi trƣờng trên đĩa và rửa bằng PBS 1X.
Cố định tế bào bằng PFA 0,4% trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.
Đục màng bằng Triton X 0,2% ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
Sử dụng BSA 5% để che phủ các liên kết không đặc hiệu và bộc lộ các liên kết đặc hiệu trên tế bào. Bƣớc này thực hiện trong 15 phút ở nhiệt độ phòng.
Ủ mẫu tế bào với kháng thể sơ cấp, là kháng thể thỏ kháng histon H3 phosphoryl hóa tại Ser10 (RAb H3PS10) trong 1 giờ, bọc bạc tránh ánh sáng. RAb H3PS10sẽ gắn đặc hiệu với vị trí histon H3 bị phosphoryl hóa trong tế bào.
Nhuộm kháng thể thứ cấp gắnAlexa Fluor 488 phát huỳnh quang xanhtrong 30 phút ở nhiệt độ phòng, tránh sáng.
Với tế bào MCF-7, tiếp tục thực hiện nhuộm kháng thể sơ cấp, là kháng thể chuột kháng Aurora B,trong 1 giờ, bọc bạc tránh ánh sáng, sau đó nhuộm với kháng thể thứ cấp gắn Alexa Flour 546 phát huỳnh quang màu đỏtrong 30 phút.
Nhuộm nhân bằng Hoechst 33342 trong 10 phút ở nhiệt độ phịng, tránh sáng.
Gắn cover lên lam kính có sẵn dung dịch bảo quản Glycerol.