(M): Giếng được nạp môi trường nuôi cấy; (MT): Giếng nạp môi trường nuôi cấy và tế bào; (VH): Giếng nạp môi trường nuôi cấy, tế bào và dung môi pha mẫu dùng làm đối chứng.
- Hút bỏ 100μl môi trƣờng ở mỗi giếng và bổ sung vào 15μl dung dịch nhuộm. Gõ nhẹ đĩa và ủ trong 4 giờ ở 37oC. Ở bƣớc này, dung dịch cần đƣợc bọc kín để tránh ánh sáng.
- Bổ sung vào giếng 100μl hỗn hợp dung dịch hòa tan/dừng phản ứng, gõ nhẹ đĩa và ủ trong 1 giờ.
- Đo mật độ quang học của dung dịch trong giếng bằng máy Microplate Reader ở bƣớc sóng 540nm.
- Dựa vào giá trị mật độ quang học, ta xác định đƣợc % tỷ số tăng sinh (A) của tế bào, từ đó đánh giá đƣợc độ độc đối với tế bào của chế phẩm. A đƣợc tính theo cơng thức:
A(%) = VT
H x 100(1)
VH: giá trị trung bình của mật độ quang học ở các giếng thử với dung môi pha thuốc. T: giá trị trung bình của mật độ quang học ở các giếng thử với thuốc.
Nếu A = 50% có nghĩa là thuốc có tác dụng gây độc và làm chết 50% tế bào. Nồng độ thuốc mà tại đó giá trị A đạt 50% gọi là liều gây chết 50% tế bào, ký hiệu là IC50. Đây là giá trị để đánh giá độc tính của thuốc đối với tế bào. Phƣơng pháp tính tốn giá tri IC50 đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của bộ kit.
2.3.3. Thử độc tính của Derrone sử dụng phƣơng pháp xCELLigence
Nguyên lý
Trƣớc đây, việc đo khả năng tăng sinh hay sự chết của tế bào dƣới tác động của thuốc thử chỉ thể hiện đƣợc ở một thời điểm nhất định. Một công nghệ mới đã đƣợc phát triển do Roche Applied Science kết hợp với ACEA Biosciences, cho phép kiểm tra tế bào theo thời gian, sử dụng đĩa nuôi cấy tế bào chuyên dụng. Hệ thống máy xCELLigence có thể đo và định lƣợng khả năng bám đáy đĩa, sự sinh trƣởng, cũng nhƣ sự chết của tế bào, hay bất kỳ một sự thay đổi nào về tính chất, từ đó đƣa ra đồ thị biểu diễn chỉ số tế bào (CI – cell index) theo thời gian[45].
Hình 12: Các thành phần chính (trái) và ngun tắc hoạt động (phải) của hệ thống xCELLigence
Thiết bị trung tâm của hệ thống xCELLigence là mạng lƣới cảm biến điện gắn ở dƣới đáy của đĩa 96 giếng (E-plate 96). Việc đo điện trở của những điện cực cảm biến này cho phép phát hiện và theo dõi những thay đổi của tế bào trên điện cực đó. Khả năng sống, số lƣợng, hình thái và độ bám dính của tế bào, tất cả đều ảnh hƣởng đến điện trở của điện cực.Ngoài ra, giá trị điện trở còn phụ thuộc vào
diện tích bám của tế bào lên điện cực.Số lƣợng tế bào càng lớn, tế bào bám càng khỏe, càng trải dài ra bề mặt đĩa thì giá trị điện trở càng cao.
Hệ thống máy xCELLigence đƣợc cung cấp bởi nhà sản xuất Roche Applied Science (Đức) và Biosciences (Hoa Kỳ), gồm có 4 thành phần chính là máy phân tích RTCA (RTCA Analyzer), RTCA SP Station, đĩa 96 giếng có cảm biến điện (E- plate 96) và một phần mềm (RTCA Control Unit) (Hình 12).
Các tín hiệu điện trở từ đĩa E-Plate 96 đƣợc truyền đến máy phân tích thơng qua thành phần RTCA SP Station. Tất cả các kết quả đo từ máy phân tích sẽ đƣợc phần mềm RTCA Control Unit điều khiển, đồng thời ghi lại, tính tốn và vẽ đồ thị một cách chi tiết và chính xác. Ngồi ra phần mềm này cịn có rất nhiều ứng dụng hữu ích khác nhƣ tính tốn chỉ số IC50 ở từng thời điểm độc lập hay thời gian nhân đôi của tế bào… Hệ thống máy xCELLigence là một phƣơng pháp hiện đại với độ nhạy, chính xác, tin cậy cao và rất dễ sử dụng, tình trạng tế bào ở từng thời điểm đƣợc theo dõi hoàn toàn tự động.Phƣơng pháp này có thể thực hiện đƣợc trong nhiều mục đích thí nghiệm khác nhau nhƣ xác định khả năng bám dính và lan rộng, thử độc tính hay khả năng gây apoptosis của chất, xác định tín hiệu thụ thể, thậm trí có thể thực hiện trên virus.
Các bước thực hiện
Trong nghiên cứu, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp xCELLigence để theo dõi sự tăng sinh của tế bào và thử độc tính của chất Derrone lên các dòng tế bào khác nhau, cụ thể gồm có MCF-7, H1299 và HeLa, với đối chứng là VX-680, từ đó tìm ra giá trịIC50. Chúng tơi tiến hành thí nghiệm theo các bƣớc của hệ thống máy xCELLigence nhƣ sau:
- Một đĩa RTCA Resistor Plate 96 với các thông số chuẩn đƣợc đƣa vào máy để kiểm tra tín hiệu và khả năng hoạt động của các thiết bị trong hệ thống. - Kiểm tra tín hiệu của đĩa E-Plate 96 bằng cách cho mơi trƣờng khơng có tế
bào vào đĩa và đo trong 15 phút. Đĩa có thể sử dụng đƣợc khi kết quả đo xấp xỉ giá trị 0.
- Đƣa tế bào HeLa vào giếng với mật độ 5000 tế bào/180μl môi trƣờng/giếng và để tế bào bám đĩa ổn định trong khoảng 24 giờ ở điều kiện 37o
C, 5% CO2. Thí nghiệm đƣợc thiết kế tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp thử độc tính bằng MTT, chỉ khác là ở phƣơng pháp này, đối chứng dƣơng chúng tôi sử dụng là VX- 680 với dải nồng độ là 0,465 – 0,372 – 0,186 – 0,093 – 0,0465 μg/ml.
- Ủ thuốc: ủ tế bào ở mỗi giếng với 20µl thuốc thử đã pha. Gõ nhẹ vào thành đĩa cho thuốc phân bố đều rồi ủ trong tủ ấm 37oC, 5% CO2.
- Dừng thí nghiệm sau 200 giờ thực hiện. Sử dụng dữ liệu thu đƣợc từ phần mềm RTCA Control Unit để xử lý và tính chỉ số IC50.
2.3.4. Miễn dịch huỳnh quang
Trong đề tài, chúng tôi thực hiện phƣơng pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang để xác định khả năng ảnh hƣởng của Derrone lên sự phosphoryl hóa H3 tại Ser10 với đối chứng là VX-680.
Nồng độ thuốc thử:
- Chế phẩm Derrone (Der): 10, 15 và 30 μg/ml. - VX-680: 0,196 μg/ml.
- Taxol: 0,3 μg/ml.
Dòng tế bào nghiên cứu: HeLa và MCF-7.
Quy trình thí nghiệm:
- Chuẩn bị 5 đĩa nuôi cấy tế bào 35mm, mỗi đĩa chứa 3 coverglass sạch, đã khử trùng. Đƣa tế bào vào đĩa với mật độ 600.000 tế bào/1,8ml môi trƣờng ni cấy, chia làm 5 mẫu thí nghiệm tƣơng ứng gồm:
ĐCDM Taxol 0,3 μg/ml Taxol 0,3 μg/ml + VX-680 0,093μg/ml Taxol 0,3 μg/ml + Der 15μg/ml Taxol 0,3 μg/ml + Der 30 μg/ml (*) Với dòng MCF-7, sử dụng một nồng độ Derrone là 10 μg/ml.
- Để tế bào bám xuống bề mặt coverglass và sinh trƣởng ổn định sau 24 giờ nuôi cấy ở tủ ấm 5% CO2, 37oC.
- Tiến hành ủ tế bào với Taxol 0,3 μg/ml trong 8 giờ. - Tiếp tục ủ tế bào với VX-680 và Derrone trong 15 giờ.
- Quan sát, chụp ảnh tế bào và bắt đầu tiến hành nhuộm miễn dịch huỳnh quang theo các bƣớc nhƣ sau:
Hút bỏ môi trƣờng trên đĩa và rửa bằng PBS 1X.
Cố định tế bào bằng PFA 0,4% trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.
Đục màng bằng Triton X 0,2% ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
Sử dụng BSA 5% để che phủ các liên kết không đặc hiệu và bộc lộ các liên kết đặc hiệu trên tế bào. Bƣớc này thực hiện trong 15 phút ở nhiệt độ phòng.
Ủ mẫu tế bào với kháng thể sơ cấp, là kháng thể thỏ kháng histon H3 phosphoryl hóa tại Ser10 (RAb H3PS10) trong 1 giờ, bọc bạc tránh ánh sáng. RAb H3PS10sẽ gắn đặc hiệu với vị trí histon H3 bị phosphoryl hóa trong tế bào.
Nhuộm kháng thể thứ cấp gắnAlexa Fluor 488 phát huỳnh quang xanhtrong 30 phút ở nhiệt độ phòng, tránh sáng.
Với tế bào MCF-7, tiếp tục thực hiện nhuộm kháng thể sơ cấp, là kháng thể chuột kháng Aurora B,trong 1 giờ, bọc bạc tránh ánh sáng, sau đó nhuộm với kháng thể thứ cấp gắn Alexa Flour 546 phát huỳnh quang màu đỏtrong 30 phút.
Nhuộm nhân bằng Hoechst 33342 trong 10 phút ở nhiệt độ phòng, tránh sáng.
Gắn cover lên lam kính có sẵn dung dịch bảo quản Glycerol.
2.3.5. Phƣơng pháp đếm tế bào dòng chảy Flow Cytometry
Nguyên lý