H3PS10
Cấu trúc hóa học của Derrone cung cấp bởi Viện Dƣợc liệu chứa một số nhóm cấu trúc tƣơng tự nhƣ các phân tử ức chế hoạt tính của enzymAurora kinaza đang đƣợc nghiên cứu hiện nay.Từ nhận định này, chúng tôi tiến hành kiểm tra khả năng ức chế hoạt tính Aurora Bkinaza của Derrone trên dòng tế bào ung thƣ cổ tử cung HeLa và dòng tế bào ung thƣ vú MCF-7 bằng cách so sánh khả năng biểu hiện của H3PS10,chính là thƣớc đo hoạt tính của enzyme kinaza này, theo phƣơng pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang và phƣơng pháp đếm tế bào dòng chảy Flow Cytometry.
3.4.1. Đánh giá sự biểu hiện của H3PS10 dƣới ảnh hƣởng của Derrone bằng phƣơng pháp miễn dịch huỳnh quang phƣơng pháp miễn dịch huỳnh quang
Các tế bào HeLa và MCF-7 đƣợc nhuộm huỳnh quang miễn dịch và quan sát trên hệ thống kính hiển vi laze quét đồng tụ LSM 510 (Zeiss). Tất cả các mẫu đều đƣợc quan sát và chụp lại với cùng một thông số đồng nhất, đảm bảo so sánh đúng về biểu hiện của histon H3 phosphoryl hóa tại Ser10. Đồng thời trong quá trình chụp, chúng tơi cũng xen kẽ chụp lại đối chứng để đảm bảo tín hiệu huỳnh quang giữa các mẫu không bị sai lệch theo thời gian nguồn laze đƣợc hoạt hóa.
3.4.1.1. Sự biểu hiện H3PS10 trên dòng tế bào HeLa dưới tác động của Derrone
Hình 34: Sự biểu hiện H3PS10 tại các kỳ khác nhau trong quá trình phân chia của tế bào HeLaở mẫu đối chứng sinh học
A – Kỳ đầu; B – Kỳ giữa; C – Kỳ sau
Xanh lục: H3PS10; Xanh da trời: Nhân tế bào; Mũi tên vàng: tế bào ở kỳ phân chia
Với mẫu đối chứng, tín hiệu huỳnh quang màu xanh lục biểu hiện mạnh và rõ ràng ở tất cả các kỳ của nguyên phân. Sự phân bố của tín hiệu phù hợp với các vị trí phân bố của H3PS10 trên lý thuyết.Các tế bào ở ngun phân có dạng co trịn lại, màng nhân tiêu biến.Ở kỳ đầu, nhiễm sắc thể co xoắn, H3PS10đƣợc biểu hiện và định vị tại tâm độngcho đến kỳ giữa(Hình 34-A; B).Sang kỳ sau, sự biểu hiện này di chuyển cùng nhiễm sắc thể về hai cực của tế bào (Hình 34 – C) và giảm dần cho đến kỳ cuối.Các tế bào ở kỳ trung gian có dạng dẹt, trải rộng trên nền ni cấy, khơng biểu hiện sự phosphoryl hóa histon H3. Một số tế bào biểu hiện là các tế bào ở cuối pha G2 chuẩn bị bƣớc vào phân bào, đây là giai đoạn tế bào tổng hợp các
nguyên liệu chuẩn bị cho phân chia, trong đó có quá trình khởi động cuộn xoắn, cũng là lúc histon H3 bắt đầu đƣợc phosphoryl hóa và biểu hiện.
So sánh hình thái và tín hiệu huỳnh quang ở các mẫu tế bào HeLa ủ thuốc, chúng tôi rút ra một số nhận xét:
- Mẫu tế bào ủ với Taxol,tín hiệu nhuộm H3PS10 vẫn xuất hiện ở các tế bào đang phân chia, cƣờng độ tín hiệu mạnh và rõ ràng. So với mẫu đối chứng tín hiệu khơng có sự khác biệt (Hình 35 – A).Nhƣ vậy Taxol khơng ảnh hƣởng tới q trình H3PS10 của Aurora kinaza.
Hình 35: So sánh biểu hiện của H3PS10 trên tế bào HeLa dưới tác động của thuốc A – Taxol; B – Taxol + VX-680 0,093μg/ml; C – Taxol + Derrone 15 μg/ml và D –
Taxol + Derrone 30μg/ml
Xanh lục: H3PS10; Mũi tên vàng: tế bào ở nguyên phân
- VX680 khi ủ với tế bào có ảnh hƣởngđến tín hiệu H3PS10 rất mạnh. Một tỷ lệ lớn tế bào đang phân chia biểu hiện H3PS10 yếu, tín hiệu huỳnh quang
giảm rõ rệt so với đối chứng. Đặc biệt, nhiều tế bào gần nhƣ khơng biểu hiện tín hiệu này.
- Tƣơng tự nhƣ VX-680, Derrone cũng có khả năng làm giảm tín hiệu H3PS10 đáng kể ở cả hai nồng độ. Đặc biệt ở nồng độ 30μg/ml, tuy xuất hiện ít hơn VX-680 nhƣng cũng có một số tế bào đang phân chia có tín hiệu huỳnh quang gần nhƣ bằng 0, chứng tỏ Derrone ở nồng độ này có khả năng ức chế hồn tồn sự phosphoryl hóa histon H3.
3.4.1.2. Dịng tế bào MCF-7
Hình 36: So sánh biểu hiện của H3PS10 và Aurora B trên tế bào MCF-7 dưới tác động của VX-680, Derrone với đối chứng
(Xanh lục: H3PS10; Đỏ: Aurora B; Xanh lam: Nhân)
Trong thí nghiệm với dịng MCF-7, ngồi việc nhuộm miễn dịch huỳnh quang với kháng thể kháng histon H3 phosphoryl hóa, chúng tơi thực hiện nhuộm
biểu hiện của Aurora B và khả năng hoạt động phosphoryl hóa của Aurora B lên H3. Kết quả chúng tơi thu đƣợc một số hình ảnh trên Hình 36.
Kết quả nhuộm miễn dịch huỳnh quang trên dòng tế bào MCF-7 tƣơng đồng với kết quả trên dòng HeLa.Ở mẫu đối chứng và mẫu tế bào ủ với Taxol, tín hiệu huỳnh quang H3PS10 (xanh) và Aurora B (đỏ) đều rất rõ nét và phân bố chính xác trên nhiễm sắc thể.Điều này chứng tỏ Taxol thực sự khơng có ảnh hƣởng đến cả sự biểu hiện và hoạt động của Aurora B và H3PS10. Tuy nhiên ở mẫu tế bào ủ với Derrone 10 μg/ml và VX680 0,093μg/ml, tín hiệu H3PS10 bị ức chế biểu hiện hoàn toàn, trong khi Aurora B vẫn biểu hiện với tín hiệu bình thƣờng.
3.4.2. Định lƣợng ảnh hƣởng của Derrone lên H3PS10 bằng phƣơng pháp đếm tế bào dòng chảy tế bào dòng chảy
Phƣơng pháp đếm tế bào dịng chảy cho phép định lƣợng hóa khả năng ức chế biểu hiện H3PS10 của Derrone. Kết quả thu đƣợc chúng tôi biểu diễn trên Hình 37.
Hình 37: Biểu đồ thể hiện cường độ tín hiệu H3PS10 của tế bào dưới tác động của Derrone 15μg/ml so với đối chứng Taxol trên dòng tế bào HeLa
Nhìn vào biểu đồ ta có thể thấy ở mẫu đối chứng Taxol, 84,9% số tế bào phân chia có biểu hiện mạnh H3PS10. Tuy nhiên ở mẫu tế bào ủ với Derrone, tỷ lệ tế bào phân chia biểu hiện H3PS10 mạnh giảm đáng kể, chỉ còn 43,1% trong khi số
tế bào biểu hiện H3PS10 yếu chiếm tỷ lệ cao, lên đến 51,3%. Kết quả này cho thấy Derrone có khả năng ức chế biểu hiện H3PS10 trong tế bào lên đến 41,8%.
3.5. THẢO LUẬN
Hiện nay, các thuốc chống phân bào nhƣ Colchicine, họ Taxane (paclitaxel, dcetaxel) hay Vinblastine đƣợc sử dụng rất nhiều trong việc điều trị ung thƣ[21]. Tuy nhiên những chất này có thể ảnh hƣởng đến cả tế bào thƣờng, tế bào phân chia và không phân chia, gây suy tủy và các bệnh thần kinh bằng cách ức chế sự giải trùng hợp các sợi trục thần kinh hay tác động đến các tế bào thần kinh đệm [34].Trong những năm gần đây, đã có nhiều chất chống phân bào đƣợc nghiên cứu với tác động đặc hiệu hơn vào quá trình phân bào, nhằm tăng hiệu quả và giảm độc tính so với các thuốc truyền thống.
Trong những nghiên cứu trƣớc đây, chúng tôi đã tiến hành sàng lọc thuốc từ 24 chất đƣợc cung cấp bởi nhóm nghiên cứu của TS. Phƣơng Thiện Thƣơng, Viện Dƣợc liệu Trung Ƣơng cung cấp. Cùng với đó, việc xác định và so sánh cấu trúc phân tử của các chất này với các chất chống phân bào điển hình, chúng tơi dự đốn rằng hợp chất Derrone có thể ảnh hƣởng đến quá trình phân bào, mà đích đến là Aurora B. Bƣớc đầu, chúng tơi tiến hành thử độc tính của chế phẩm Derrone lên ba dòng tế bào ung thƣ là MCF-7, H1299 và HeLa. Kết quả cho thấy Derrone có khả năng ức chế và tiêu diệt tế bào ung thƣ, thể hiện ở giá trị IC50 lần lƣợt là 11,16; 11,71 và 10,55 μg/ml. Theo thang chuẩn đánh giá độ độc của chất ởBảng 9 thì giá trị IC50 của Derrone nằm trong khoảng giới hạn giữa mức 1 và 2, chứng tỏ độc tính mạnh đối với tế bào.Mặt khác, Derrone cũng có khả năng ức chế tăng trƣởng của dòng tế bào HEK 293, là dịng tế bào thƣờng chuyển dạng có khả năng phân chia vô hạn nhƣ tế bào ung thƣ. Điều này chứng tỏ rằng Derrone có thể là một chất chống phân bào (anti – mitotic drug).
Bảng 9: Thang chuẩn đánh giá độ độc của chất thông qua giá trị IC50[59] IC50 Mức xếp hạng Đánh giá độ độc IC50 Mức xếp hạng Đánh giá độ độc < 1 μg/ml 3 Rất cao 1 – 10 μg/ml 2 Cao 10 –100 μg/ml 1 Trung bình >100 μg/ml 0 Thấp
Sự tác động của Derrone lên sự sinh trƣởng và chết của quần thể tế bào có nhiều điểm tƣơng đồng với VX-680, một chất ức chế Aurora B điển hình.Ở cả ba dịng tế bào ung thƣ mà chúng tơi thử nghiệm, Derrone và VX-680 nồng độ thích hợp đều có khả năng làm tăng chỉ số tế bàođạt cực đại cao hơn và sớm hơn so với mẫu đối chứng. Đặc biệt, hai chất này đều làm tốc độ chết của tế bào tăng mạnh sau khi giá trị CI đại cực đại.Kiểm tra tác động lên điểm kiểm sốt thoi vơ sắc của Derrone với đối chứng VX-680, chúng tôi nhận thấy rằng các tế bào bị bắt giữ tại kỳ giữa của nguyên phân do hoạt động của Paclitaxel hoạt hóa điểm kiểm sốt này, dƣới ảnh hƣởng của Derrone làm tế bào có khả năng thốt khỏi ngun phân để trở lại pha G1 của kỳ trung gian. Với VX-680, điều này có thể giải thích là do thuốc tác động lên tế bào bằng cách ức chế hoạt tính của Aurora kinaza, làm tế bào vƣợt qua điểm kiểm soát thoi phân bào và đi vào “mitotic slippage”[17, 29, 53]. Hiện tƣợng này có thể xảy ra trong nhiều chu kỳ liên tiếp của tế bào, làm tế bào trở thành dạng đa nhân 4n hoặc 8n, kích thƣớc tế bào tăng cao hơn nhiều so với đối chứng, từ đó làm chỉ số CI tăng cao. Tế bào sau đó sẽ chết theo chƣơng trình[53]. Vậy có thể tác động của Derrone cũng có cơ chế tƣơng tự VX-680.Quả thật, chúng tơi đã chứng minh rằng Derrone có ảnh hƣởng lớn đếnchu trình tế bào. Quần thể tế bào dƣới tác động của Derrone trong 24 giờ có tỷ lệ tế bào ở pha S tăng cao bất thƣờng. Không chỉ vậy, gần 20% số tế bào ở dạng đa nhân, bộ nhiễm sắc thể > 4N, trong khi quần thể đối chứng chỉ là 4,4%. Điều này chứng tỏ rằng thuốc có khả năng tác động làm tế bào bị bắt giữ lại ở pha S hoặc vƣợt qua đƣợc điểm kiểm soát và tiếp tục đi vào G1.
Ngồi ra, ba dịng MCF-7, H1299 và HeLa có sự biểu hiện p53 khơng giống nhau. Nếu nhƣ MCF-7 biểu hiện p53 bình thƣờng, thì dịng HeLa biểu hiện p53 rất yếu, gần nhƣ khơng có, hay H1299 thậm trí khơng có gen p53. Tuy nhiên sự tác động của Derrone lên 3 dòng tế bào này cho kết quả khá tƣơng đồng về giá trị IC50, chỉ số CI cũng nhƣ kiểu hình của tế bào.Vậy chúng tơi có thể nhận định rằng cơ chế tác động của Derrone lên tế bào không liên quan đến biểu hiện và hoạt động của p53.
Năm 2012, Fang Xie và cộng sự đã chứng minh đƣợc rằng một số hợp chất thuộc nhóm flavonoid là Luteolin, 3-Hydroxyflavone có khả năng tiêu diệt tế bào ung thƣ thơng qua ức chế hoạt tính của Aurora kinaza [27, 57]. Cũng là một thành viên của nhóm flavonoid, cơng thức hóa học của Derrone có nhiều điểm tƣơng đồng với Luteolin hay 3-Hydroxyflavone. Sử dụng phần mềm AutoDock Vina dự đoán khả năng liên kết của Derrone với phân tử Aurora B, đồng thời so sánh với những chế phẩm đã đƣợc nghiên cứu trƣớc, nhận thấy rằng Derrone có khả năng liên kết ái lực với phân tử Aurora B (PDB: 4B8M) [52]. Đặc biệt, vị trí liên kết của Derrone trùng khớp với vị trí gắn của Luteolin và VX-680 lên phân tử Aurora B. Đây chính là vị trí gắn cạnh tranh với ATP để ức chế hoạt tính của Aurora B khi thực hiện chức năng (Hình 38).
Hình 38: Dự đốn khả năng và vị trí liên kết của Derrone với Aurora B sử dụng phần mềm AutoDock Vina, so sánh với Luteolin và VX-680 [57]
Trong nghiên cứu này, để chứng minh và tìm hiểu sâu về cơ chế tác động của Derrone, chúng tôi tiến hành kiểm tra ảnh hƣởng của Derrone lên sự phosphoryl hóa H3 tại Ser10, một thƣớc đo hoạt tính của Aurora Bkhi nghiên cứu các chất có khả năng ức chế enzym này[23, 57]. Kết quả cho thấy sự tác động của Derrone làm giảm rõ rệt sự biểu hiện H3PS10 mà không ảnh hƣởng đến biểu hiện của Aurora B, từ đó ảnh hƣởng đến chu trình tế bào, sự nhân đôi và tăng sinh của tế bào ung thƣ. Q trình phosphoryl hóa H3 tại Ser10 có vai trị quan trọng trong cả kỳ trung gian và giai đoạn phân chia tế bào. Ở kỳ trung gian, quá trình này giúp nhiễm sắc thể tháo xoắn đồng thời kích hoạt sao chép hay phiên mã của gen[7, 37, 39].Sự ngăn cản q trình phosphoryl hóa H3 tại Ser10 gây ra sự bất thƣờng trong sao chép và tổng hợp protein cần thiết cho q trình phân chia. Chính vì vậy, Derrone khi tác động lên tế bào, ức chế sự phosphoryl hóa H3 làm tế bào bị dừng ở pha S, làm tỷ lệ tế bào ở pha S tăng cao. Không chỉ vậy, một lƣợng lớn tế bàotrở thành dạng đa nhân cũng là do ảnh hƣởng của Derrone lên quá trình phosphoryl hóa quan trọng này. Sự giảm biểu hiện của H3PS10 có thể do Derrone ức chế hoạt tính của Aurora kinaza B, dẫn đến hiện tƣợng “mitotic slippage”, làm tăng tỷ tệ đa nhân trong quần thể tế bào.
Mặc dù tƣơng tự nhƣ VX-680, Derrone có khả năng làm giảm đáng kể sự biểu hiện của H3PS10, tuy nhiên kích thƣớc tế bào khi ủ với Derrone không tăng nhiều so với đối chứng. Nhƣ vậy, chúng tôi dự đốn rằng Derrone có thể tác động lên khơng chỉ Aurora B, mà cịn có thể ảnh hƣởng đến Aurora A, Aurora C hoặc thậm trí lên các enzym kinaza khác, có liên quan trực tiếp đến sự phosphoryl hóa H3 tại Ser10 nhƣ VRK1 hay Nercc1, hoặc gián tiếp lên sự phosphoryl hóa histon H3 tại Ser10[39, 56]. Ngồi ra, PP1 cũng có thể là một đích tác động đầy tiềm năng. Việc kích thích sự phiên mã hay hoạt động của PP1 cũng có thể gây ra sự giảm mạnh mẽ biểu hiện H3PS10 trong phân bào[37, 39]. Để chứng minh đƣợc liệu Derrone có thực sự ức chế Aurora kinaza, cần phải tiến hành các thí nghiệm nhƣ phản ứng kinase assay, hoặc hệ thống phân tích tƣơng tác enzym – cơ chất để khẳng định điều này [49].
Mặc dù vậy, từ những đặc điểm trên, chúng tôi nhận định rằng Derrone có thể là một chất ức chế Aurora kinaza mức độ in vitro trên tế bào. Với nguồn gốc từ thiên nhiên, việc tìm ra những chất có khả năng ức chế Aurora kinaza sẽ là một bƣớc tiến mới và có tính khả thi trong việc điều trị ung thƣ với độc tính thấp và độ an tồn cao. Ngồi ra, việc tìm hiểu sâu về cấu trúc phân tử của Derrone có thể giúp các nhà khoa học tìm ra những phƣơng án cải thiện tiềm năng và hiệu quả của chế phẩm trong việc điều trị ung thƣ.
KẾT LUẬN
Từ những kết quả thí nghiệm và phân tích trên đây, chúng tôi rút ra một số kết luận nhƣ sau:
- Chế phẩm Derrone thể hiện độc tính trên dịng tế bào ung thƣ vú MCF-7, dòng tế bào ung thƣ phổi H1299 và dòng tế bào ung thƣ cổ tử cung HeLa với giá trị IC50 lần lƣợt là 11,16;11,71 và 10,55μg/ml (R2> 0,99). Ngoài ra Derrone cũng tác động lên tế bào thận phôi HEK 293 với IC50 là 10,86μg/ml (R2> 0,9).
- Derrone có khả năng tác động đến chu trình của tế bào, làm tăng tỷ lệ tế bào ở pha S, tăng tỷ lệ tế bào đa nhân và kích thích tế bào thốt khỏi sự điều hịa của điểm kiểm sốt thoi vơ sắc.
- Derrone có tác dụng ức chế rõ ràng biểu hiện của histon H3 bị phosphoryl hóa ở nồng độ 15 và 30 μg/ml in vitro. Derrone nồng độ 15μg/ml có khả năng ức chế biểu hiện H3PS10 lên đến 41,8%. Đặc biệt, nồng độ 30 μg/ml có khả năng ức chế hoàn toàn biểu hiện của tế bào.
KIẾN NGHỊ
- Sử dụng phƣơng pháp Flow Cytometry và Western Blot để định lƣợng chính xác tác động ức chế biểu hiện H3PS10 của Derrone, trên những dòng tế bào ung thƣ khác nhau.
- Thực hiện phản ứng Kinase assay trên các enzym kinaza để đánh giá chính xác về cơ chế tƣơng tác giữa Derrone và Aurora kinaza.
- Tiếp tục kiểm tra tác động của Derronelên mơ hình 2D, 3D các dịng tế bào