3.2. KẾT QUẢ THỬ ĐỘC TÍNH TRÊN CÁC DỊNG TẾ BÀO MCF-7,
3.2.1. Kết quả thử độc tính trên dịng MCF-7 bằng xCELLigence
Hình 14: Đồ thị biểu diễn trạng thái của MCF-7 dưới tác dụng của Derronetheo thời gian
Nhìn vào đồ thị ta có thể thấy, ở mẫu tế bào MCF-7 ủ với chế phẩm Derrone, sự tác động của thuốc tuân theo quy luật nồng độ khá rõ ràng.
- Mẫu ĐCDM có chỉ số tế bào tăng đều, phát triển bình thƣờng và đạt đỉnh ở thời điểm 156 giờ sau ủ thuốc, sau đó giảm mạnh. Giá trị cực đại của chỉ số CI ở mẫu này đạt 12, tiếp sau thời điểm 158 giờ là giai đoạn chết của tế bào do mật độ tế bào trên giếng đã đạt giá trị tối đa, chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng không đủ đáp ứng nhu cầu của tế bào (Hình 14 và Hình 16).
- Với hai nồng độ cao nhất là 80 và 40 μg/ml, chỉ số CI giảm mạnh, nhanh chóng xuống mức 0 chỉ sau 20 giờ ủ thuốc và duy trì tình trạng này đến khi kết thúc thí nghiệm (Hình 14 và Hình 15). Điều này chứng tỏ Derrone ở các nồng độ này có độc tính rất mạnh đối với tế bào MCF-7.
- Ở hai nồng độ tiếp theo là 20 và 10 μg/ml, tế bào có sự tăng trƣởng, thể hiện ở chỉ số CI tăng. Tuy nhiên tốc độ tăng thấp hơn hẳn so với đối chứng. Mẫu tế bào ủ thuốc nồng độ 20 μg/ml và ĐCDM đạt đỉnh cùng thời điểm là 156 giờ, tuy nhiên giá trị CI chỉ đạt giá trị 4, giảm 66,67% so với ĐCDM. Ở nồng độ 10 μg/ml, giá trị CI cực đại ngay ở thời điểm 146 giờ, tuy nhiên cũng chỉ đạt đƣợc 8, giảm 33,33% so với giá trị cực đại của mẫu ĐCDM (Hình 15).
- Đối với nồng độ thấp nhất là 5 μg/ml, đƣờng đồ thị khơng có hiện tƣợng giảm sau ủ thuốc mà vẫn tiếp tục tăng cùng với đối chứng. Tuy nhiên chỉ số CI ở mẫu này đạt đỉnh ngay từ thời điểm 146 giờ, sớm hơn 10 giờ so với ĐCDM, với giá trị là 12,8. Đặc biệt, tốc độ chết của tế bào diễn ra ở nồng độ này cao hơn hẳn so với ĐCDM. Nếu tính tại thời điểm 20 giờ sau khi giá trị CI đạt cực đại, ở mẫu ĐCDM, chỉ số CI giảm từ 12 xuống 7,4, trong khi đó, tại nồng độ 5 μg/ml, chỉ số này giảm từ 12,8 xuống 5,2, nghĩa là tốc độ chết tăng 65,2% so với đối chứng (Hình 15).Quan sát tế bào bằng kính hiển vi soi ngƣợc, nhận thấy tế bào chết dạng co trịn lại tạo thành những mảnh nhỏ trên giếng ni cấy. Đây là kiểu chết apoptosis đặc trƣng.
Hình 15: Phân tích tốc độchết của tế bào MCF-7 sau khi CI đạt giá trị cực đại ở mẫu ủ Derrone
VX-680 ở bốn nồng độ cao nhất thể hiện khả năng ức chế tăng trƣởng, khi tốc độ tăng trƣởng của tế bào ủ thuốcthấp hơn hẳn so với đối chứng.Tế bào ủ VX- 680 ở những nồng độ này khơng có sự khác biệt đáng kể về khả năng sống, bám dính.Với mẫu tế bào ủ VX-680 ở nồng độ 0,0465μg/ml, chỉ số CI tăng cao theo thời gian và khá tƣơng đồng với mẫu ĐCDM (Hình 16). Tuy nhiên khi quan sát trên kính hiển vi soi ngƣợc, chúng tôi nhận thấy tế bào MCF-7 ủ VX-680 có kích thƣớc lớn hơn nhiều so với mẫu đối chứng. Một số lƣợng nhỏ tế bào đã bắt đầu co lại, nổi lên trên và chết đi.
Hình 16: Đồ thị biểu diễn trạng thái của MCF-7 dưới tác dụng của VX-680 theo thời gian
Từ những nhận xét trên, chúng tôi kết luận rằng chế phẩm Derrone có độc tính đối với tế bào MCF-7.
Sử dụng những tiện ích trong phần mềm RTCA Control Unit, chúng tôi đã vẽ đƣợc đồ thị biểu diễn giá trị IC50 của MCF-7 đối với chế phẩm Derrone ở thời điểm từ 118 giờ đến 148 giờ. Chúng tơi lựa chọn thời điểm này vì đây là giai đoạn của pha tăng trƣởng tế bào đối chứng, sự so sánh tác động của chế phẩm mới có ý nghĩa.
Hình 17: Đồ thị biểu diến giá trị IC50 của Derrone đối với dịng MCF-7 từ thời điểm 118 đến 148 giờ thí nghiệm
Nhìn vào đồ thị ta có thể thấy tác động của Derrone lên dòng MCF-7 từ thời điểm 118 giờ đến 148 giờ là tƣơng đối ổn định thông qua giá trị IC50 xấp xỉ 11 μg/ml. Dựng đƣờng cong đáp ứng liều của MCF-7 dƣới tác động của Derrone và VX-680 ở thời điểm 148 giờ, là thời điểm gần cuối của pha tăng trƣởng tế bào đối chứng, trƣớc khi tế bào bƣớc vào giai đoạn cân bằng ổn định và chết, chúng tôi thu đƣợc hình ảnh nhƣ Hình 18.
Hình 18: Đường cong đáp ứng liều của MCF-7 dưới sự tác động của Derrone ở 148 giờ
Chúng tôi nhận thấy rằng sự tác động của Derrone và VX-680 đều tuân theo quy luật nồng độ. Nồng độ càng cao thì khả năng gây chết tế bào càng mạnh và ngƣợc lại.Chỉ số IC50 của Derrone và VX-680 đối với MCF-7 ở thời điểm 148 giờ lần lƣợt là 11,16μg/ml (R2 = 0,99) và 0,049 μg/ml (R2 = 0,91). Giá trị R2> 0,9 chứng minh kết quả là đủ độ tin cậy.
3.2.2. Kết quả thử độc tính trên dịng H1299 bằng xCELLigence
Hình 19: Đồ thị biểu diễn trạng thái của H1299 dưới tác dụng của Derrone theo thời gian
Hình 20: Đồ thị biểu diễn trạng thái của H1299 dưới tác dụng của VX-680 theo thời gian
Sau 190 giờ thực hiện thí nghiệm, chúng tôi thu đƣợc những hình ảnh trên Hình 19 và Hình 20. Sự tác động của Derrone và VX-680 đều tuân theo quy luật nồng độ rất rõ ràng.
- Mẫu ĐCDM: chỉ số tế bào ban đầu tăng đều. Đến thời điểm 76 giờ, tế bào bắt đầu ở trạng thái cân bằng, giá trị CI lúc này là 5,1, đƣờng đồ thị đi ngang
và duy trì liên tục trong khoảng 4 ngày, sau đó mới giảm xuống. Sự chết của tế bào ở thời điểm này là do chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng đã cạn kiệt. - Mẫu tế bào ủ với VX-680, hai nồng độ cao nhất có tác động ức chế sự sinh
trƣởng của tế bào khá rõ. Tuy nhiên, hai nồng độ thấp thì hồn tồn ngƣợc lại. Chỉ số CI cực đại ở nồng độ 0,0465 và 0,093 μg/ml lần lƣợt là 12 và 10,8, cao gấp 2,4 và 2,16 lần so với ĐCDM. Tế bào nhanh chóng bị chết sau đó, chỉ số CI giảm mạnh xuống giá trị 0 khi ĐCDM vẫn còn đang ở mức cao(Hình 20).
- Kết quả với chất Derrone có nhiều điểm tƣơng đồng so với hiện tƣợng xảy ra ở mẫu ủ VX-680. Hai nồng độ cao là 80 và 40 μg/ml có ảnh hƣởng rất mạnh đến tế bào, chỉ số CI giảm xuống nhanh chóng ở thời điểm ngay sau khi ủ thuốc. Ở nồng độ 20 μg/ml, tế bào tăng trƣởng với tốc độ thấp. Giá trị CI cực đại ở nồng độ này là 5,2 tại thời điểm 154 giờ, xấp xỉ mẫu ĐCDM. Đặc biệt, ở hai nồng độ thấp nhất là 5 và 10 μg/ml, chỉ số CI tăng lên cao hơn hẳn đối chứng. Chỉ số CI ở hai nồng độ này đạtcực đại ở thời điểm lần lƣợt là 116 và 120 giờ, sau đó giảm nhanh chóng. Phân tích tốc độ chết của tế bào tăng ở hai mẫu Derrone 5 và 10 μg/ml cho giá trị cao hơn hẳn so với đối chứng. 20 giờ sau khi giá trị CI đạt cực đại, ở mẫu ĐCDM, chỉ số CI giảm từ 5,1 xuống 3,6, trong khi với mẫu ủ Derrone 10 μg/ml, chỉ số này giảm từ 8 xuống 5,4, tốc độ chết tăng 73,3% so với đối chứng. Đặc biệt ở nồng độ 5 μg/ml, chỉ số CI cực đại tăng rất cao, lên đến giá trị 10,4, và 20 giờ sau đó thì giảm xuống cịn 6,8, nghĩa là tốc độ chết của tế bào ở nồng độ này tăng 140% so với ĐCDM (Hình 21). Mặc dù giá trị CI ở mẫu tế bào ủ Derrone tăng cao, tuy nhiên khi quan sát trên kính hiển vi soi ngƣợc, kích thƣớc tế bào khơng có thay đổi rõ rệt so với đối chứng.
Tiến hành tính tốn và xây dựng đồ thị biểu diễn chỉ số IC50 của Derrone trên dòng H1299 ở các thời điểm khác nhau trong khoảng 23 giờ của pha tăng trƣởng ở mẫu đối chứng, chúng tôi thu đƣợc kết quả trên Hình 22.
Hình 21: Phân tích tốc độ chết của tế bào MCF-7 sau khi CI đạt giá trị cực đại ở mẫu ủ Derrone nồng độ 5 và 10 μg/ml
Hình 22: Đồ thị biểu diến giá trị IC50 của Derrone đối với dòng H1299 từ thời điểm 53 đến 76 giờ thí nghiệm
Đồ thị cho kết quả tƣơng tự với kết quả trên dòng MCF-7. Trong 23 giờ của pha tăng trƣởng, giá trị IC50 của Derrone tƣơng đối ổn định từ 11 – 14μg/ml.Tiến hành xây dựng đồ thị biểu diễn đƣờng cong đáp ứng liều của tế bào H1299 với Derrone ở thời điểm 76 giờ, là thời điểm gần cuối của pha tăng trƣởng, chúng tôi cũng thu đƣợc kết quả phù hợp với những nhận xét ban đầu (Hình 23). Giá trị IC50 thu đƣợc có độ tin cậy cao (R2
tơi cũng tính tốn giá trị IC50 ở thời điểm này, thu đƣợc giá trị IC50 là 0,12μg/ml (R2 = 0,99).
Hình 23: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều dòng H1299 dưới tác động của Derrone tại thời điểm 76 giờ
3.2.3. Kết quả thử độc tính trên dịng HeLa bằng xCELLigence
Ở dòng tế bào HeLa, sự tác động của Derrone và VX-680 cũng tuân theo quy luật nồng độrõ ràng nhƣ ở dòng MCF-7 và H1299. Đối với cả VX-680 và chế phẩm Derrone, 4 nồng độ cao đều làm ức chế mạnh mẽ khả năng tăng sinh tế bào, chỉ số CI giảm so với đối chứng, đặc biệt là ở ba nồng độ cao nhất. Tuy nhiên ở nồng độ thấp nhất thì có sự khác biệt rõ rệt (Hình 25).
Hình 24: Đồ thị biểu diễn trạng thái của HeLa dưới tác dụng của Derrone theo thời gian
Hình 25: Đồ thị biểu diễn trạng thái của HeLa dưới tác dụng của VX-680 theo thời gian
- Với VX-680 nồng độ 0,0465μg/ml, đƣờng đồ thị tăng trƣởng đồng đều với đối chứng cho đến thời điểm 80 giờ.
- Ở mẫu tế bào ủ với Derrone nồng độ 10μg/ml, tốc độ tăng trƣởng của tế bào thấp hơn so với đối chứng. Ở nồng độ 5 μg/ml, chúng tôi thu đƣợc kết quả tƣơng tự nhƣ với hai dòng MCF-7 và H1299,giá trị CI tăng lên cao hơn rõ rệt so với đối chứng, thậm trí cao hơn VX-680.
Tiếp tục tính tốn và xây dựng đồ thị biểu diễn chỉ số IC50 của chế phẩm Derrone ở các thời điểm trong pha tăng trƣởng của dòng tế bào ung thƣ cổ tử cung HeLa, chúng tơi thu đƣợc kết quả nhƣ trên Hình 26. Nhìn vào đồ thị ta có thể thấy, trong pha tăng trƣởng, tác dụng của Derrone lên tế bào HeLa là rất ổn định, dao động trong khoảng 10,5 – 11 μg/ml.
Tiếp đó chúng tơi tiến hành xây dựng đƣờng cong đáp ứng liều của HeLa dƣới sự tác động của Derrone ở thời điểm 78 giờ, chính là thời điểm tế bào mẫu đối chứng đang ở cuối pha tăng trƣởng, từ đó tính giá trị IC50. Kết quả thu đƣợc có độ tin cậy cao với R2> 0,99, giá trị IC50 của Derrone là 10,55μg/ml. Với VX-680, giá trị IC50 ở thời điểm này là 0,086μg/ml (R2> 0,99).
Hình 27: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều dòng HeLa dưới tác động của Derrone ở thời điểm 78 giờ
Nhƣ vậy có thể tổng hợp các giá trị IC50 của Derrone và VX-680 lên ba dòng tế bào nghiên cứu là MCF-7, H1299 và HeLa thực hiện bằng phƣơng pháp xCELLigence nhƣ sau:
Bảng 7: Tổng hợp giá trịIC50và chỉ số tƣơng quan R2 của Derrone và VX-680
Chất MCF-7 H1299 HeLa IC50 (μg/ml) R2 IC50 (μg/ml) R2 IC50 (μg/ml) R2 Derrone 11,16 0,99 11,71 0,99 10,55 0,99 VX-680 0,049 0,91 0,12 0,99 0,086 0,99 Biểu hiện p53 +/+ -/- +/-
Từ bảng tổng hợp giá trị, chúng tôi đƣa ra một số nhận xét:
- Tất cả các giá trị IC50 thu đƣợc đều có chỉ số tƣơng quan R2> 0,9, chứng tỏ kết quả hoàn toàn đáng tin cậy.
- Chỉ số IC50 của Derrone tính tốn ở thời điểm cuối pha tăng trƣởng của tế bào khơng có sự khác biệt nhiều, dao động từ 10 – 12 μg/ml. Cùng với một nghiên cứu trƣớc đây khi thử độc tính của Derrone trên dịng KPL4 cho giá trịIC50 = 17,8 μg/ml, chứng tỏ độc tính của chế phẩm tƣơng đối ổn định trên các dòng tế bào khác nhau.
- Giá trị IC50 của VX-680 thấp, dao động trong khoảng 0,1 μg/ml thể hiện độc tính mạnh đối với tế bào ung thƣ.
Dựa vào những kết quả thu đƣợc, chúng tơi chọn dịng tế bào ung thƣ cổ tử cung HeLa và dòng tế bào ung thƣ vú MCF-7 để tiến hành cho thí nghiệm nhuộm miễn dịch huỳnh quang tiếp theo, do khả năng sinh trƣởng ổn định, thời gian nhân đôi ngắn và bám dính tốt trên bề mặt ni cấy.
3.2.4. Kết quả thử độc tính trên dịng HEK 293 bằng phƣơng pháp MTT
Tiến hành thử độc tính của Derrone trên dịng tế bào thận phơi ngƣời HEK 293 bằng phƣơng pháp MTT đồng thời quan sát tế bào trên kính hiển vi soi nổi, chúng tơi thu đƣợc một số hình ảnh trên Hình 28.
Sau 48 giờ ủ thuốc, sự tác động của Derrone cũng tuân theo quy luật nồng độ. Ở nồng độ cao là 80 và 40 μg/ml, tế bào co tròn lại và chết nhanh.Ở mẫu ủ Derrone nồng độ 20 và 10 μg/ml, tế bào không bị ảnh hƣởng từ những thời điểm đầu tiên, tuy nhiên sau khi ủ 48 giờ, tế bào có hiện tƣợng chết apoptosis. Những tế bào sống bám dƣới đáy đĩa cũng bắt đầu co lại với hình thái thay đổi, khả năng sống cũng giảm dần. Derrone nồng độ 5 μg/ml gần nhƣ không ảnh hƣởng lên tế bào khi quan sát trên kính hiển vi soi ngƣợc (Hình 28).
Hình 28: Hình ảnh tế bào sau 48 giờ ủ với chế phẩm Derrone và Taxol
Các nồng độ thuốc (µg/ml) tương ứng: Derrone - 20 (A) ; 10 (B) ; 5 (C) ; Taxol – 3(D)
Đối với mẫu tế bào ủ với đối chứng Taxol, tế bào bắt đầu có hiện tƣợng co trịn lại với tỷ lệ cao ở thời điểm 12-15 giờ sau khi ủ mẫu, do cơ chế tác động của Taxol là làm bền sợi vi ống, ngăn cản sự giải trùng hợp của tế bào ở kỳ sau. Vì vậy lúc này, tế bào đang bị dừng ở kỳ giữa của nguyên phân.Đến thời điểm 48 giờ, một số lƣợng lớn tế bào khi bị bắt giữ quá lâu cũng chết apoptosis, đặc biệt là ở những nồng độ cao nhƣ 30 và 3 μg/ml.
Sau khi thực hiện phản ứng kiểm tra độc tính của chất bằng phƣơng pháp MTT, đo mật độ quang học ở bƣớc sóng 540 nm, chúng tơi sử dụng phần mềm Excel để xử lý số liệu đo OD thu đƣợc. Từ kết quả tính chỉ số tăng sinh chúng tôi dựng đƣờng cong đáp ứng liều của HEK 293 dƣới tác dụng của Derrone và Taxol (Hình 29).
Hình 29: Đường cong đáp ứng liều của HEK 293 với chất Derronevà Taxol
(x = log(nồng độ); y = A(%))
Sử dụng các hàm tốn học và phƣơng trình tƣơng quan hồi quy dựa trên đƣờng cong sinh trƣởng dựng đƣợc, chúng tơi đã tính tốn đƣợc giá trị IC50 của Derrone và Taxol đối với dịng tế bào thận phơi ngƣời HEK 293 lần lƣợt là 10,86μg/ml (R2 = 0,95) và 0,058μg/ml (R2 = 0,97). Cả hai giá trị này đều có R2> 0,95, do đó kết quả là hoàn toàn đáng tin cậy. Với Taxol, giá trị IC50 thu đƣợc là phù hợp với những kết quả đã đƣợc công bố trƣớc đây [30].
3.3. ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA DERRONE LÊN CHU TRÌNH TẾ BÀO
3.3.1. Đánh giá ảnh hƣởng của Derrone lên điểm kiểm sốt thoi phân bào
Trong thí nghiệm này, chúng tơi thực hiện trên hai dòng tế bào là HeLa và MCF-7.Trƣớc tiên, chúng tôi tiến hành ủ mẫu tế bào với Taxol 0,3 μg/ml trong 8 giờ trƣớc khi ủ thuốc. Nhƣ đã giới thiệu ở Chƣơng I, cơ chế tác động của Taxol là làm bền vi ống, ngăn cản sự giải trùng hợp vi ống khi tế bào bƣớc vào kỳ sau. Vì vậy khi ủ với Taxol trong 8 giờ, một lƣợng lớn tế bào bị bắt giữ lại ở kỳ giữa, co