2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.5. Phƣơng pháp đếm tế bào dòng chảy Flow Cytometry
Nguyên lý
Hình 13: Thành phần cấu tạo và hoạt động của hệ thống máy Flow Cytometry[41]
Phƣơng pháp đếm tế bào dòng chảy là một sáng tạo mang tính đột phá trong việc nghiên cứu cũng nhƣ ứng dụng trên tế bào. Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng để phân tích đồng thời các đặc điểm lý hóa của từng tế bào đơn với tốc độ phân tích từ vài trăm đến vài nghìn tế bào trong một giây và có độ tin cậy cao. Các thành phần chính của hệ thống gồm có hệ thống tạo dòng chất lỏng, hệ thống quang học và hệ thống điện tử (Hình 13) [41]. Nguyên lý hoạt động của hệ thống này là thơng qua hệ thống tạo dịng chất lỏng, mẫu huyền phù tế bào đƣợc “nắn chỉnh” thành một dòng đơn từng tế bào một. Dòng tế bào đơn này đi qua hệ thống quang học với tốc độ rất cao, khoảng 1000 tế bào/giây. Khi một tế bào hay một vật thể đi qua nguồn sáng, ánh sáng của nguồn sáng sẽ tƣơng tác với vật thể tạo ra các ánh sáng tán xạ góc thẳng và góc bên. Hai loại ánh sáng tán xạ này sẽ đƣợc đƣa đến hệ thống thu nhận tín hiệu để nhận biết, từ đó đƣa ra chỉ số FSC và SSC và đƣợc hệ thống điện tử
điểm trên máy tính. Chỉ số FSC sẽ thể hiện kích thƣớc của tế bào, trong khi SSC thể hiện mức độ phức tạp trong thành phần của tế bào. Ngoài ra, nếu tế bào/vật thể đƣợc nhuộm màu huỳnh quang thì sẽ phát ra tín hiệu khi đƣợc kích thích bằng ánh sáng phù hợp, và cũng đƣợc hệ thống thu nhận tín hiệu nhận biết và phân tích một cách chính xác. Cả ba chỉ số FSC, SSC và tín hiệu huỳnh quang sẽ thể hiện đặc trƣng cho mỗi loại tế bào khác nhau [2].
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp đếm tế bào dòng chảy với hai mục đích là kiểm tra ảnh hƣởng của Derrone lên chu trình tế bào và sử biểu hiện H3PS10.Đối tƣợng chúng tơi chọn là dịng tế bào HeLa, nồng độ Derrone sử dụng là 15 μg/ml.
2.3.5.1. Kiểm tra ảnh hưởng của Derrone lên chu trình tế bào sử dụng phương pháp đếm tế bào dịng chảy
Trong thí nghiệm này, chúng tơi sử dụng phƣơng pháp đếm tế bào dòng chảy để xác định hàm lƣợng ADN trong tế bào khi đƣợc ủ với chế phẩm Derrone. Các bƣớc thực hiện tiến hành nhƣ sau:
- Đƣa tế bào vào đĩa petri 35mm với mật độ tế bào là 106
tế bào/giếng, trong môi trƣờng đầy đủ, nuôi tế bào bám đĩa ổn định qua đêm.
- Thay môi trƣờng không chứa FBS và nuôi trong 24 giờ. - Tiếp tục thay môi trƣờng đầy đủ, nuôi ổn định trong 2 giờ. - Ủ tế bào với Derrone, nồng độ cuối cùng đạt 15 μg/ml.
- Sau 8, 15 và 24 giờ ủ thuốc, tế bào đƣợc thu lại và cố định bằng methanol 70% trong 1 giờ ở 4oC.
- Nhuộm tế bào với PI (có chứa RNAse) trong 15 phút, bọc bạc.
- Hòa tan và rửa tế bào bằng PBS 1X, sau đó đo kết quả trên máy FACS Canto II.
2.3.5.2. Kiểm tra ảnh hưởng của Derrone lên sự biểu hiện H3PS10 sử dụng phương pháp đếm tế bào dòng chảy
- Đƣa tế bào vào đĩa petri 35mm với mật độ tế bào là 106 tế bào/giếng trong môi trƣờng đầy đủ, nuôi tế bào bám đĩa ổn định qua đêm.
- Tiến hành ủ tế bào với Taxol 0,3 μg/ml trong 8 giờ. - Tiếp tục ủ tế bào với Derrone 15 μg/ml trong 15 giờ.
- Loại bỏ môi trƣờng, chỉ thu các tế bào phân chia, sau đó cố định sơ cấp bằng PFA 1,5% trong 10 phút.
- Tiếp tục cố định và đục màng bằng methanol 90% trong 30 phút ở -20oC. - Tiếp tục ủ tế bào với BSA 5% trong 15 phút để phủ các liên kết không đặc
hiệu trên bề mặt màng tế bào.
- Ủ mẫu tế bào với kháng thể sơ cấp RAb H3PS10 trong 1 giờ, bọc bạc tránh ánh sáng.
- Nhuộm kháng thể gắnAlexa Fluor 488 phát huỳnh quang xanhtrong 30 phút ở nhiệt độ phòng, tránh sáng.
- Nhuộm nhân bằng PI (có chứa RNAse) trong 15 phút, bọc bạc.
- Hòa tan và rửa tế bào bằng PBS 1X, sau đó đo kết quả trên máy FACS Canto II.