3.1. Thiết kế phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương
3.1.3. Thiết kế trình tự mồi và probe cho phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HB
pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB.
Căn cứ vào độ ổn định và tính đa hình, đột biến, vùng gen được lựa chọn thiết kế mồi và probe cho quy trình định lượng HBV pgRNA là vùng gen S.
Kết quả lựa chọn cặp mồi/probe:
Sử dụng công cụ thiết kế mồi và các thông tin liên quan đến đoạn gen của HBV pgRNA, nhóm nghiên cứu đã thiết kế một số cặp mồi/TaqMan probe có khả năng khuếch đại đặc hiệu trình tự gen đích quan tâm. Ba cặp mồi/probe được kí hiệu lần lượt là: 482/198/361, 482/585/361, và 482/223/361. Thông qua phản ứng RT-qPCR và đánh giá trên mẫu chuẩn dương HBV pgRNA S4 và S5, nhóm nghiên cứu tiến hành đánh giá nhằm lựa chọn ra cặp mồi/probe có khả năng khuếch đại tốt nhất trình tự quan tâm.
Hình 6: Kết quả phản ứng RT-qPCR đánh giá mồi/probe.
Chú thích hình: Các cặp mồi được kí hiệu số hiệu lần lượt là 198+, 223+, 585+. Hai mẫu chuẩn S5, S4 được lựa chọn để đánh giá với kí hiệu tương ứng là 12 và 34. Các mẫu có chữ “AM”
là chứng âm của phản ứng
Sử dụng 2 mẫu chuẩn với nồng độ trung bình được lựa chọn trong bộ mẫu chuẩn: S4 (104), S5 (105). Mỗi mẫu chuẩn được chia thành các ống nhỏ; 2 ống mẫu chuẩn tương ứng của S5, S4 ký hiệu là 12 và 34 được sử dụng cho quá trình tối ưu.
Như kết quả Hình 5, các cặp mồi và probe được thiết kế đều có khả năng khuếch đại trình tự đích quan tâm (HBV pgRNA), ngồi ra các cặp mồi và probe đều cho thấy tính đặc hiệu cao khi các chứng âm đều khơng cho thấy tín hiệu khuếch đại. Tuy nhiên những cặp mồi và probe này có điểm khác biệt rất lớn, đó chính là hiệu suất khuếch đại khác nhau. Theo như kết quả của phản ứng, cặp mồi có ký hiệu 482/223/361 (là cặp mồi và probe có trình tự đã được trình bày ở trên) cho thấy tiềm năng là có tín hiệu khuếch đại tốt nhất trong cả ba cặp mồi và probe. Tín hiệu huỳnh quang cũng như Ct được thể hiện trên bảng kết quả đều chỉ ra cặp mồi và probe với kí hiệu 223 chính là cặp mồi và probe được lựa chọn cho quy trình định lượng tải lượng HBV pgRNA bằng phương pháp RT-qPCR.
Sau đó nhóm nghiên cứu tiếp tục khảo sát trên một số mẫu bệnh nhân CHB đã tách chiết và các mẫu của người khỏe mạnh tham gia nghiên cứu, các kết quả
đều chỉ ra rằng cặp mồi và probe kí hiệu 482/223/361 có tín hiệu khuếch đại tốt nhất, và nhóm nghiên cứu quyết định lựa chọn cặp mồi và probe này cho những quy trình tối ưu tiếp theo.
Sau quá trình thử nghiệm và đánh giá bước đầu để tìm ra cặp mồi/probe có khả năng khuếch đại hiệu quả và đặc hiệu HBV pgRNA, nhóm nghiên cứu đã xác định cặp mồi/probe tối ưu cho quy trình RT-qPCR.
Trình tự mồi phiên mã ngược đặc hiệu của HBV là: 5’ - GACAAACGGGCAACATACCT - 3’ ([nt] 476 – 457).
Trình tự forward primer là: 5’ - ATGTGTCTGCGGCGTTTTAT - 3’ ([nt] 377 – 396).
Trình tự probe là : 5’ - FAM – ATCCTGCTGCTATGCCTCAT - BHQ1 - 3’ ([nt] 410 – 429).
Hình 7: Bản đồ trình tự mồi/probe cho quy trình RT-qPCR