2.5.1 Nguyên tắc
Nguyên tắc của phương pháp: các loại Asen hữu cơ và vô cơ được tách nhau trên cột sắc ký tương ứng sử dụng pha động của hệ HPLC, chúng được phun và ion hóa. Các ion thu được được vận chuyển thông qua một cổng lấy mẫu vào một phổ kế khối để đo. Trong nghiên cứu này, cột phân tích là cột trao đổi anion Hamilton PRP X100, kích thước hạt trao đổi là 10µm, đường kính bên trong 25cm x 4.1mm. Trong sắc ký trao đổi anion, pha tĩnh có bề mặt tích điện dương (+) trong khi các ion mẫu lại có điện tích âm (-). Điện tích âm càng mạnh thì nó sẽ bị hút bởi điện tích dương trên pha tĩnh, và do đó nó càng mất nhiều thời gian để rửa giải cột.
Trong nghiên cứu này, sự phân tách được thực hiện bởi một hệ thống HPLC với cột trao đổi anion (Hamilton PRP X-100). Mẫu được đưa vào bởi một bơm nhu động kết nối máy phun sương micromist với buồng phun. Tín hiệu của Asen với m/z =75 đã được thu thập. Hệ thống HPLC được kết nối trực tiếp với bơm nhu động bằng một ống dẫn hẹp và các sản phẩm của từng phân đoạn được đưa vào máy phun sương trong buồng phun. Các dạng Asen đã được tách sẽ chuyển qua thiết bị ICP/MS để định lượng.
2.5.2 Phương pháp khảo sát điều kiện tối ưu
Các điều kiện tối ưu của hệ phát hiện ICP/MS sẽ được khảo sát khi có mặt các dạng Asen; các điều kiện tách sẽ được thử nghiệm với các dạng riêng rẽ và đồng thời; các điều kiện tách các dạng ra khỏi nền mẫu sẽ được đánh giá qua độ thu hồi chiết tách các dạng ra khỏi nền mẫu huyết tương trắng bằng các phương pháp khảo sát đơn biến hoặc tối ưu hóa đồng thời các yếu tố ảnh hưởng.
Nguyên tắc của phương pháp đơn biến: trong quá trình khảo sát chỉ thay đổi một yếu tố có ảnh hưởng đến kết quả đo và giữ cố định các yếu tố khác. Chọn điều kiện cho kết quả tốt nhất. Tiếp tục khảo sát các yếu tố khác theo nguyên tắc trên.
2.5.3 Đánh giá phương pháp phân tích
Phương pháp được đánh giá thơng qua các công cụ thống kê như: độ lặp lại, độ thu hồi, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng và đường hồi quy tuyến tính của phương pháp [9, 29].
Độ lặp của một phương pháp: đặc trưng cho mức độ gần nhau giữa các giá
trị riêng lẻ xi của cùng một mẫu phân tích, được tiến hành bằng một phương pháp phân tích, trong cùng điều kiện thí nghiệm (người phân tích, trang thiết bị, phịng thí nghiệm) trong khoảng thời gian ngắn và được đánh giá qua giá trị khoảng biến thiên của kết quả phân tích.
Cách tiến hành: Phân tích lặp lại 3 lần một mẫu huyết thanh, sử dụng phương pháp tốn học tính độ lệch chuẩn của 3 kết quả đo từ đó tính khoảng biến thiên của kết quả phân tích để đánh giá độ lặp lại của phép đo.
Dùng mẫu huyết thanh của người nghi có thể bị nhiễm độc Asen (mã số bệnh nhân 4347), xử lý mẫu theo đúng quy trình thu được dung dịch đo. Sau đó tiến hành phân tích lặp lại 3 lần cho cùng dung dịch đo vừa xử lý với các điều kiện tối ưu của thiết bị đã được tối ưu hóa. Ghi nhận và so sánh kết quả thu được sau 3 lần phân tích.
Độ thu hồi của một chất phân tích:
H% = 𝐶𝑐ó 𝑡ℎê𝑚 𝑐ℎ𝑢ẩ𝑛− 𝐶𝑛ề𝑛
𝐶𝑐ℎ𝑢ẩ𝑛 đượ𝑐 𝑡ℎê𝑚 𝑣à𝑜 . 100%
Cách tiến hành: Khảo sát độ thu hồi trên 5 dạng asen ở 2 khoảng nồng độ khác nhau thuộc 2 khoảng của đường chuẩn là 20 µg/L và 50 µg/L bằng cách thêm chuẩn vào một mẫu huyết thanh thực tế đã biết nồng độ.
Dùng một mẫu huyết thanh, xử lý mẫu theo đúng quy trình, thu được dung dịch mẫu. Chia dung dịch mẫu thành 3 phần, mang dung dịch mẫu phần thứ nhất tiến hành đo nhằm xác định nồng độ các dạng Asen có trong dung dịch mẫu vừa mới xử lý.
Sau khi đã xác định được nồng độ các dạng Asen có mặt trong dung dịch mẫu, tiếp tục chia nhỏ 2 phần dung dịch mẫu còn lại thành 2 phần. Tiến hành thêm vào
mẫu dung dịch chuẩn 5 dạng Asen nồng độ 20ppb và 50ppb (2 mẫu dung dịch thêm chuẩn 5 dạng Asen nồng độ 20 ppb và 2 mẫu thêm chuẩn 5 dạng Asen nồng độ 50ppb). Tiến hành đo đối với 4 mẫu sau khi thêm chuẩn, tính tốn và đánh giá độ thu hồi của các mẫu.
Giới hạn phát hiện của phương pháp là nồng độ mà tại đó giá trị xác định
được lớn hơn độ không đảm bảo đo của phương pháp. Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được.
Giới hạn phát hiện của phương pháp được tính theo cơng thức:
𝐿𝑂𝐷 =3. 𝑆𝐷
𝑎
Trong đó: SD là độ lệch chuẩn của nồng độ thấp nhất đường chuẩn a là độ dốc của đường chuẩn
Giới hạn định lượng của phương pháp (LOQ): là điểm thấp nhất của đường
chuẩn được coi là giới hạn định lượng nếu đảm bảo các điều kiện sau:
- Tín hiệu phân tích ở điểm LOQ phải bằng ít nhất 5 lần tín hiệu của mẫu trắng.
- Tín hiệu phân tích phải đủ lớn, độc lập và lặp lại với độ chính xác 20% và độ đúng 80–120%
- Giới hạn định lượng của phương pháp được tính theo cơng thức:
LOQ=10.𝑆𝐷 𝑎
Trong đó: SD là độ lệch chuẩn của nồng độ thấp nhất đường chuẩn a là độ dốc của đường chuẩn
Đường hồi quy tuyến tính của phương pháp: Một cách đơn giản nhất mà
được dùng để biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ và tín hiệu phân tích. Lựa chọn thơng số và sử dụng phương trình hồi quy để biểu diễn. Các điều kiện sau được dùng để xây dựng đường chuẩn:
- Các điểm khác thì sai số khơng q 15%
2.5.4 Phương pháp xử lý số liệu
Phần mềm Xcalibur version 2.0 (Thermo Scientific, Mỹ) được sử dụng để chuyển đổi, xử lý số liệu và định lượng. Các peak riêng lẻ của từng dạng As được xác định tự động trên phần mềm Xcalibur dựa vào thời gian lưu của chúng (thời gian lưu đã được khai báo trên thiết bị). Từ diện tích peak và phương trình đường chuẩn, xác định được nồng độ các dạng As xuất hiện trong mẫu đo.
3 CHƯƠNG III – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN