3.1 Nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện trên hệ thống HPLC
3.1.3 Khảo sát lựa chọn pha động
3.1.3.1 Khảo sát lựa chọn thành phần pha động
Để khảo sát ảnh hưởng của loại pha động đến khả năng tách các dạng Asen trên cột sắc kí Hamilton PRP-X 100, chúng tơi cũng tiến hành phân tích hỗn hợp 5 dạng Asen (AsB, As(III), MMA, DMA và As(V)) với nồng độ mỗi dạng asen là 50 µg/L. Hai loại pha động được chọn để khảo sát là dung dịch kalihidrophotphat KH2PO4 20mM, pH=8 và dung dịch amoni cacbonat (NH4)2CO3 50mM, pH=9. Kết quả sắc đồ thu được trên hình 3.2.
(a) (b) Hình 3.2. Sắc đồ tách của 5 dạng As nồng độ 50ppb
a. Sử dụng pha động KH2PO4 20mM, pH=8; 2% MeOH; 2%MeOH; vịng lặp mẫu 100µl; tốc độ dịng 1,0ml/phút
b. Sử dụng pha động (NH4)2CO3, pH=9; ; 2%MeOH; vịng lặp mẫu 100µl; tốc độ dịng 1,0ml/phút
Kết quả trên hình 3.2 a và 3.2 b cho thấy tín hiệu peak khi sử dụng dung dịch amonicacbonat tốt hơn, đặc biệt là tín hiệu của As(III) và AsB. Hơn nữa, khi sử dụng dung dịch photphat trong một thời gian dài sẽ làm bề mặt côn của thiết bị ICP/MS bị rỗ, làm giảm tuổi thọ và tín hiệu đo của thiết bị này. Vì vậy lựa chọn pha động là dung dịch amonicacbonat cho các khảo sát tiếp theo.
3.1.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ MeOH đến tín hiệu các dạng asen
MeOH là dung mơi hữu cơ có khả năng làm tăng tín hiệu ICP/MS cho các nguyên tố có năng lượng ion hóa trong khoảng 9-11eV. Để cải tiến độ nhạy do hiệu ứng cacbon thì một tỉ lệ nhỏ methanol đã được thêm vào pha động trong suốt q trình tối ưu hóa.
Để khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ phần trăm (C%) methanol đến khả năng tách các dạng asen trên cột sắc kí Hamilton PRP-X 100, tiến hành phân tích hỗn hợp 5 dạng Asen (AsB, As(III), MMA, DMA và As(V)) với nồng độ mỗi dạng Asen là 50 µg/L (50ppb). Nồng độ của methanol trong pha động đã được thay đổi theo các tỉ lệ: 1%, 2%, 3%, 4%, 5% về thể tích. Kết quả sắc đồ hình 3.3 (a) (b) (c) (d) AsB As(III)
DMA MMA As(V)
0 200000 400000 600000 800000 0 5 10 15 20 25 Tín h iệ u p ick/cp s Thời gian (phút) Pha động (NH4)2CO3
(e) (f)
Hình 3.3. Sắc đồ của 5 dạng As nồng độ 50ppb
(pha động là hỗn hợp dung dịch (NH4)2CO3 50mM); pH=9; vịng lặp mẫu 100µl; tốc độ dịng 1,0ml/phút.)
a. Pha động khơng có MeOH b. Pha động thêm 1%MeOH c. Pha động thêm 2% MeOH d. Pha động thêm 3% MeOH e. Pha động thêm 4% MeOH f. Pha động thêm 5% MeOH
Dựa vào sắc đồ ta thấy rằng khi pha động chỉ có (NH4)2CO3 thì các dạng tách nhau khơng rõ rệt, có hiện tượng dính peak, điều này gây khó khăn khi tính diện tích peak và xác định dạng asen.
Ở cả 5 nồng độ khác nhau của MeOH, 5 dạng Asen đều được tách, tín hiệu của As tăng lên khi tăng nồng độ MeOH nhưng đồng thời tín hiệu của đường nền cũng tăng lên. Tại nồng độ MeOH là 1%, 2%, 3% thì tín hiệu của đường nền thấp hơn ở 4% và 5%. Tuy vậy, nếu nồng độ MeOH cao có thể tạo ra bồ hóng làm giảm tín hiệu plasma. Quan sát sắc đồ thu được ta thấy tại nồng độ 2%MeOH, đỉnh peak cao hơn, đối xứng và tín hiệu tách ổn định hơn. Vì vậy nồng độ methanol 2% đã được lựa chọn cho các khảo sát tiếp theo.
3.1.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến quá trình tách
Tiến hành thí nghiệm với 5 dạng Asen (AsB, As3+, MMA, DMA và As5+) ở nồng độ 50 µg/L, thay đổi pH lần lượt các giá trị từ 7,0 đến 9,0 với bước nhảy là 0,5. Kết quả thực nghiệm cho thấy khi sử dụng phương pháp đẳng dịng thì AsB và As3+
khơng tách được khỏi nhau. Ở các giá trị pH khác nhau (7,0 – 9,0) thì thời gian lưu của 4 dạng As (AsB, As3+, MMA, DMA) không thay đổi nhiều. Riêng thời gian lưu
của As5+ tăng khi pH tăng. Tuy nhiên, ở pH=9 thì tín hiệu đo ổn định nhất, vì vậy pH = 9 được lựa chọn cho dung dịch pha động trong các khảo sát tiếp theo. (hình 3.4)
(a) (b) (c) (d) (e) Hình 3.4. Sắc đồ của 5 dạng As ở nồng độ 50ppb
(pha động là dung dịch (NH4)2CO3 50mM; 2% MeOH; vịng lặp mẫu 100µl; tốc độ dịng 1,0ml/phút)
a. Pha động có pH=7,0 b. Pha động có pH=7,5
b. Pha động có pH=8,0 d.. Pha động có pH=9,5 e. Pha động có pH=9,0
3.1.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ dòng pha động
Tốc độ dịng pha động cũng góp phần ảnh hưởng đến hiệu quả tách sắc kí vì nó liên quan đến q trình thiết lập cân bằng của chất tan trong hai pha tĩnh và pha động. Khi tốc độ pha động nhỏ, chất phân tích ra muộn, gây dỗng peak, giảm độ nhạy và tốn dung môi. Khi tốc độ pha động quá lớn có thể làm cho chất phân tích chưa tách ra khỏi nhau đã bị đẩy ra khỏi cột dẫn đến hiện tượng chồng chéo peak. Chính vì vậy một tốc độ hợp lý sẽ cho kết quả tối ưu.
Tiến hành phân tích hỗn hợp năm dạng Asen (AsB, As3+, MMA, DMA và As5+) với nồng độ mỗi dạng Asen là 50 µg/L. Tiến hành khảo sát ở 3 tốc độ pha động là 1,0mL/phút; 1,2mL/phút và 1,5mL/phút. Kết quả sắc đồ thu được trên hình 3.5
(a) (b)
(c)
Hình 3.5. Sắc đồ của 5 dạng As ở nồng độ 50ppb
pha động là hỗn hợp đệm (NH4)2CO3 10mM, 50mM); pH=9; 2% MeOH; vịng lặp mẫu 100µl.
a. Tốc độ dịng pha động 1ml/phút b. Tốc độ dòng pha động 1,2ml/phút b. Tốc độ dịng pha động 1,5l/phút
Từ kết quả hình 3.5 ta thấy ở tốc độ 1,0 ml/phút 5 dạng As được tách hoàn tồn riêng lẻ, cịn ở tốc độ 1,2ml/phút và 1,5ml/phút AsB, AsIII và DMA tách ra gần nhau. Ở tốc độ 1.5ml/phút tín hiệu peak của MMA và AsV bị thấp, do vậy tốc độ dòng pha động là 1,0 ml/phút được lựa chọn cho các khảo sát tiếp theo.
3.1.3.5 Nghiên cứu chế độ pha động
Phương pháp rửa giải của cột sắc ký có ý nghĩa rất lớn tác động đến việc tách các dạng Asen ra khỏi nhau bởi vì các dạng As có tính chất hóa lý rất giống nhau, nên ái lực của chúng với pha tĩnh sẽ có sự khác nhau rất nhỏ. Thời gian lưu của các dạng Asen cũng phụ thuộc vào phương pháp rửa giải. Trong đề tài nghiên cứu này, chỉ khảo sát 2 phương pháp rửa giải là đẳng dòng và gradient nhằm đánh giá hiệu quả, góp phần nâng cao chất lượng phân tích.
Để khảo sát đánh giá ảnh hưởng của hai phương pháp rửa giải đến khả năng tách các dạng Asen trên cột sắc kí Hamilton PRP-X 100, tiến hành phân tích hỗn hợp 5 dạng Asen (AsB, As3+, MMA, DMA và As5+) với nồng độ mỗi dạng Asen là 50 µg/L. Tốc độ pha động 1,0 mL/phút; thể tích bơm mẫu là 100 µl; 2% MeOH. Đối với phương pháp đẳng dịng, chúng tơi sử dụng pha động là dung dịch amonicacbonat (NH4)2CO3 ở một nồng độ duy nhất là 50mM, pH=9. Còn đối với phương pháp gradient cũng tiếp tục sử dụng dung dịch (NH4)2CO3 nhưng nồng độ ở 10mM và 50mM, pH=9.
Trong đó: Kênh A: MeOH
Kênh B: Đệm amonicacbonat (NH4)2CO3 50mM Kênh C: Đệm amonicacbonat (NH4)2CO3 10mM Kênh D: H2O
Chương trình Gradient
❖ Từ 0 đến 1 phút: 10mM dung dịch amonicacbonat + 2% MeOH ❖ Từ 1 đến 15 phút: 50mM dung dịch amonicacbonat + 2% MeOH ❖ Từ 15 đến 20 phút: 10mM dung dịch amonicacbonat + 2% MeOH
Kết quả trên hình 3.6 cho thấy khi sử dụng phương pháp gradient, 5 dạng As được tách hồn tồn. Cịn khi sử dụng phương pháp đẳng dịng thì AsB và As3+ khơng tách được khỏi nhau. Vì vậy, chúng tơi chọn phương pháp gradient cho việc tách 5 dạng As trên hệ ghép nối HPLC-ICP/MS.
(a) (b)
Hình 3.6. Sắc đồ của 5 dạng As ở nồng độ 50ppb
pha động là dung dịch (NH4)2CO3 10; 50mM; pH=9; 2% MeOH; vịng lặp mẫu 100µl; tốc độ dịng 1,0ml/phút.
a. Phương pháp rửa giải đẳng dòng b. Phương pháp rửa giải gradient