CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn biển sinh kháng sinh
Từ 39 mẫu nƣớc, bùn, đất thu thập đƣợc ở các vùng biển Quảng Ninh, Hải Phòng, Nghệ An, chúng tôi đã tiến hành phân lập và thu đƣợc 23 mẫu có xạ khuẩn với tổng cộng 40 chủng. Các chủng xạ khuẩn xuất hiện chủ yếu ở các mẫu đất và bùn với màu sắc và hình dạng phong phú. Trong các mẫu nƣớc hầu nhƣ khơng tìm thấy xạ khuẩn hoặc có thì cũng rất ít và mức độ khác nhau của chúng không nhiều do các mẫu đều lấy ở ven bờ trong độ sâu từ 0,2 – 5 m.
Các chủng xạ khuẩn sau khi phân lập đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng Gause 1 và một số môi trƣờng đặc trƣng cho sinh kháng sinh khác, có bổ sung nƣớc biển. Các chủng sau khi nuôi ở nhiệt độ 28 – 30oC đƣợc thử hoạt tính đối kháng vi sinh vật bằng phƣơng pháp thỏi thạch trên các mơi trƣờng có bổ sung các vi sinh vật kiểm định S. epidermidis ATCC 12228, B. cereus ATCC 11778, B. subtilis ATCC 6633, C. albicans ATCC 10231. Sau 14 – 18 giờ, đo vòng đối kháng (D-d, mm).
Kết quả đƣợc thể hiện trên bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hoạt tính đối kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn
TT Chủng xạ khuẩn Vòng kháng khuẩn (D-d, mm) S. epidemids ATCC 12228 B. cereus ATCC 11778 B. subtilis ATCC 6633 C. albicans ATCC 10231 1 NA115 22 21 24 15 2 NA118 10 0 13 0 3 NA114 0 20 0 0 4 NA119 18 9 10 0 5 NA113 26 14 25 9 6 NA1132 10 19 14 17 7 NA1134 10 12 14 18 8 NA116 0 0 12 0 9 NA117 0 0 12 0 10 M415 9 0 15 11
11 HP112 0 13 23 0 12 HP12 0 18 22 0 13 HP411 0 18 40 14 14 HPN11 0 14 0 0 15 HP 11 0 13 20 0 16 HP412 0 0 15 0 17 HP31 0 0 18 0 18 HP22 0 7 0 0 19 CB12 0 0 0 0 20 CB13 0 0 0 0 21 CB11 0 0 16 0 22 CB14 0 0 0 0 22 VK1-1 0 12 17 0 23 VK1-2 0 18 19 0 24 VK2-2 0 0 0 0 25 VK3-1 0 0 17 0 26 VK4-1 0 0 16 0 27 VD2-1 0 8 10 0 28 VD2-2 0 10 11 0 29 VD311 0 0 13 0 30 VD321 0 0 0 0 31 VD111 0 10 15 0 32 VD112 22 16 23 18 33 VD114 0 0 20 0 34 VD115 0 14 13 0 35 BB11 0 0 0 0 36 BB12 0 0 0 0 37 BB13 0 0 0 0 38 BB14 0 0 0 0 39 HPT13 0 0 0 0 40 HPX12 0 0 20 0 Tổng số chủng có hoạt tính 8 19 28 7
Qua bảng 3.1 ta thấy, có 10 chủng khơng có khả năng ức chế vi sinh vật kiểm định, 30 chủng có khả năng sinh chất kháng sinh; chiếm 75% số chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc. Điều này cho thấy, vi sinh vật biển có tiềm năng lớn đối với ngành hóa dƣợc, đặc biệt là xạ khuẩn, địi hỏi chúng ta cần có nhiều nghiên cứu hơn nữa để khai thác nguồn lợi này. Trong 30 chủng có hoạt tính kháng sinh, có 5 chủng sinh chất kháng sinh kháng cả 4 chủng vi sinh vật kiểm định (NA113, NA1132, NA1134, NA115 và VD112); có 3 chủng kháng 3 loại vi sinh vật kiểm định; 10 chủng có khả năng kháng 2 loại vi sinh vật kiểm định và 12 chủng chỉ kháng đƣợc 1 loại vi sinh vật kiểm định.
Hình 3.1. Tỉ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
S. epidermidis ATCC 12228, B. cereus ATCC 11778, B. subtilis ATCC 6633, C. albicans ATCC 10231.
Trong 30 chủng sinh chất kháng sinh thì có 8 chủng có khả năng kháng S. epidermidis ATCC 12228, chiếm tỉ lệ 20%. Chủng có hoạt tính mạnh nhất là
NA113 với vòng kháng khuẩn là 24 mm, sau đó là chủng NA115 và VD112 với vòng kháng khuẩn là 22 mm; chủng có hoạt tính yếu nhất là M415 với vịng kháng khuẩn có đƣờng kính 9 mm. Có 32 chủng khơng có khả năng đối kháng với vi khuẩn S. epidermidis ATCC 12228; 19 chủng (chiếm 47,5%) có khả năng kháng vi
khuẩn B. cereus ATCC 11778. Trong đó chủng có hoạt tính mạnh nhất là NA115 có VKK 21 mm, chủng có hoạt tính yếu nhất là HP22 với VKK là 7 mm.
Có 28 chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh kháng B. subtilis ATCC 6633
(chiếm 70%). HP411 là chủng có hoạt tính mạnh nhất (40 mm) tiếp theo đó là NA113 (25 mm), NA115 (24 mm) và VD112 (23 mm); chủng có hoạt tính kháng B.
subtilis ATCC 6633 yếu nhất là NA119 (10 mm) và VD2-1 (10 mm); 12 chủng
khơng có khả năng đối kháng với vi khuẩn B. subtilis ATCC 6633.
VD112 và NA1134 là 2 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm men C. albicans ATCC 10231 mạnh nhất (18 mm); NA113 là chủng có hoạt tính yếu nhất
(9 mm) và có tới 33 chủng khơng có khả năng sinh kháng sinh kháng C. albicans
ATCC 10231 và chỉ có 17,5% số chủng có khả năng sinh kháng sinh kháng chủng nấm men này.
Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng xạ khuẩn 3.2. Đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn
3.2.1. Đặc điểm ni cấy
Từ 30 chủng có hoạt tính kháng sinh chúng tơi đã chọn ra 2 chủng có hoạt tính mạnh nhất để tiếp tục nghiên cứu sâu hơn bao gồm NA113 và NA115.
Các chủng xạ khuẩn đƣợc nuôi trên các môi trƣờng ISP khác nhau; sau đó xác định đặc điểm hình thái, màu sắc, khả năng sinh sắc tố và melanin trên mơi trƣờng theo chƣơng trình phân loại xạ khuẩn quốc tế ISP. Màu sắc của khuẩn ti cơ
chất và khuẩn ti khí sinh đƣợc so với bảng màu của Tresner và Backus (1963). Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Màu sắc của các chủng xạ khuẩn trên các môi trƣờng ISP khác nhau
Kí hiệu chủng
Mơi trƣờng
Khuẩn ti Sắc tố
KTKS KTCC Săc tố tan Melanin
NA113
ISP1 Xám 5fe Đỏ 5gc - -
ISP2 Xám 3ge Xám nâu 7ih -
ISP3 Xám 2fe Đỏ nâu 4ea Đỏ nâu 4ge
ISP4 Trắng a Trắng a -
ISP5 Trắng b Xám 41i Xanh 18ec
ISP6 Đỏ 4ea Đỏ 5gc - -
ISP7 Xám 2dc Xám 3ig - -
NA115
ISP1 Xám 4ig Đỏ 7ca - -
ISP2 Xám 5fe Xám 3ih -
ISP3 Xanh 11/2ge Đỏ 4ge -
ISP4 Xám d Tím 11ac Đỏ 6ec
ISP5 Đỏ 5dc Đỏ 5gc Xanh 19ge
ISP6 Đỏ 7ca Đỏ 4ie - -
ISP7 Trắng a Vàng 2fe - -
Qua bảng 3.2 ta thấy cả 2 chủng NA113 và NA115 đều thuộc nhóm xám (Gray), đều sinh sắc tố tan trên các môi trƣờng khác nhau. Chủng NA113 sinh sắc tố nâu đỏ trên môi trƣờng ISP3 và xanh tím than trên mơi trƣờng ISP5. Chủng NA115 sinh sắc tố cam trên môi trƣờng ISP4 và sắc tố xanh trên môi trƣờng ISP5. Qua quan sát cho thấy cả 2 chủng đều không sinh melanin, không làm thay đổi màu sắc của mơi trƣờng ISP1, ISP6 và ISP7.
Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc của chủng NA113 trên mơi trƣờng ISP2, ISP3
Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc của chủng NA115 trên môi trƣờng ISP2, ISP3
3.2.2. Đặc điểm hình thái
Để nghiên cứu đặc điểm hình thái của xạ khuẩn, nuôi cấy các chủng trên môi trƣờng ISP2 trong thời gian 14-28 ngày ở 37oC. Sau đó quan sát hình thái cuống sinh bào tử dƣới kính hiển vi quang học và hiển vi điện tử quét. Đối với xạ khuẩn, đặc điểm của cuống sinh bào tử, bề mặt bào tử là đặc điểm phân loại rất quan trọng.
Hình 3.5. Cuống sinh bào tử (A) và bề mặt bào tử (B) của chủng NA113
B A
Qua quan sát cho thấy cả 2 chủng xạ khuẩn đều có bề mặt bào tử trơn, nhẵn. Chủng NA113 có cấu trúc chuỗi bào tử chùm 2 - 4 nhánh, đầu hơi xoắn móc câu (RF), trên mỗi chuỗi bào tử có từ 3 - 15 bào tử. Chủng NA115 có chuỗi bào tử dài, xoắn nhiều vòng (RFS), số lƣợng từ 10 – 50 bào tử trên mỗi chuỗi.
Hình 3.6. Cuống sinh bào tử (A) và bề mặt bào tử (B) của chủng NA115 3.3. Đặc điểm sinh lí - sinh hóa
3.3.1. Khả năng sử dụng nguồn nitơ
Để đánh giá khả năng sử dụng nguồn nitơ, chúng tôi nuôi cấy xạ khuẩn trên mơi trƣờng ISP8 có bổ sung các nguồn nitơ khác nhau với tỉ lệ 1%. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Khả năng sử dụng các nguồn nitơ của các chủng xạ khuẩn
Nguồn nitơ Chủng xạ khuẩn
NA113 NA115 L-Asparagin monohydrat + + L-Histidine monohydrat - - L- Phenylalanin ± - L-Leucin ++ + L-Tryptophan + + L-Arginin monodo - - L-Isoleucin + ++ L-Valin - - L-Methionin - ± A B
L-Lysin - +
L-Threonin + +
L-Cystein - +
2 Amino 2 hydroxy-methyl 1,3 promo - +
(NH4)2SO4 - ±
NH4Cl - +
Yeast extract (cao nấm men) ++ ++
Trypton ++ ++
Casein + +
Pepton ++ ++
Bột đậu tƣơng + +
Đối chứng âm (ISP8) ± ±
Ghi chú: - Không sinh trưởng, ± Sinh trưởng yếu, + Sinh trưởng bình thường, ++ Sinh trưởng tốt
Qua bảng 3.3 ta thấy, chủng NA113 có khả năng sinh trƣởng tốt trên các nguồn nitơ L-leucin, cao nấm men, pepton, trypton. Không sinh trƣởng trên môi trƣờng sử dụng nguồn nitơ L-histidine monohydrat, L-arginin monodo, L-valin, L- methionin, L-lysin, L-cystein, 2 amino 2 hydroxy-methyl 1,3 promo và trên mơi trƣờng có nguồn nitơ vơ cơ.
Chủng NA115 khơng có khả năng sinh trƣởng khi sử dụng nguồn nitơ L- phenylalanin, L-arginin monodo và L-valin. Sinh trƣởng mạnh nhất trên mơi trƣờng có L-isoleucin, cao nấm men, trypton và pepton. Cả hai chủng đều sinh trƣởng yếu trên môi trƣờng đối chứng âm.
3.3.2. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon
Để đánh giá khả năng sử dụng nguồn cacbon, chúng tôi tiến hành nuôi xạ khuẩn trên mơi trƣờng ISP9 có bổ sung các nguồn cacbon khác nhau với nồng độ 1%, đọc kết quả sau 7 – 14 ngày nuôi cấy. Việc nghiên cứu khả năng sử dụng nguồn cacbon nhằm đánh giá đặc điểm của chủng xạ khuẩn, bên cạnh đó giúp định hƣớng tìm nguồn cacbon thích hợp cho q trình lên men. Kết quả nghiên cứu khả năng sử dụng nguồn cacbon đƣợc trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Khả năng sử dụng các nguồn cacbon của các chủng xạ khuẩn
Nguồn đƣờng Chủng xạ khuẩn
NA113 NA115
D-Glucose (đối chứng dƣơng) + +
Arabinose - + Saccarose ± + D-xylose ± ± Myo-Inositol ± + Mannitol + + D-fructose ± + L-rhamnose + + Raffinose - - D-Cellulose ± + D-Mantose monohydrat ± ± Mannose ± + Tinh bột + + Chitin + +
ISP9 khoáng (đối chứng âm) - ±
Ghi chú: + Sinh trưởng tốt, ± Sinh trưởng yếu (kém hơn đối chứng dương)
- Không sinh trưởng
Qua bảng 3.4 ta thấy, chủng NA113 có khả năng sinh trƣởng tốt ở mơi trƣờng có D-glucose (đối chứng dƣơng), mannitol, L-rhamnose, chitin và tinh bột; khơng có khả năng sinh trƣởng trên mơi trƣờng có arabinose và raffinose và ISP9 (đối chứng âm).
Tinh bột, chitin, mannose, D-cellulose, L-rhamnose, D-fructose, manitol, myo-Inositol, saccarose, arabinose và D-glucose là nguồn đƣờng thích hợp nhất để ni cấy chủng NA115. Trên mơi trƣờng có D-xylose, D-mantose monohydrat và mơi trƣờng đối chứng âm (ISP9 khống) chủng này sinh trƣởng yếu và khơng có khả năng sinh trƣởng trên mơi trƣờng có raffinose.
3.3.3. Khả năng chịu muối NaCl
Do nồng độ muối trong nƣớc biển cao (khoảng 3%) nên các chủng xạ khuẩn biển thƣờng có khả năng chịu muối tốt hơn các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc từ các môi trƣờng khác. Để kiểm tra khả năng chịu muối, chủng xạ khuẩn đƣợc ni trên mơi trƣờng ISP2 có bổ sung NaCl với các nồng độ khác nhau. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.5. Khả năng sinh trƣởng của xạ khuẩn ở nồng độ NaCl khác nhau
Xạ khuẩn Nồng độ NaCl (%) 1 2 3 4 5 7 10 13 15 NA113 ++ ++ ++ ++ ++ + ± - - NA115 ++ ++ ++ + ± - - - -
Ghi chú: - Không sinh trưởng, ± Sinh trưởng yếu, + Sinh trưởng bình thường, ++ Sinh trưởng tốt
Ở nồng độ muối từ 1-3%, cả hai chủng đều sinh trƣởng tốt, riêng chủng NA113 vẫn sinh trƣởng tốt ở nồng độ NaCl 5% và không sinh trƣởng ở nồng độ NaCl ≥ 13%. Khi nồng độ NaCl ≥ 5% chủng NA115 sinh trƣởng yếu và không sinh trƣởng ở 7%.
3.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng
Các chủng xạ khuẩn đƣợc nuôi trên môi trƣờng ISP2 ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Khả năng sinh trƣởng của chủng xạ khuẩn NA113 và NA115 ở các điều
kiện nhiệt độ khác nhau
Chủng xạ khuẩn Nhiệt độ (o C) 4 10 20 30 40 45 NA113 - ± + ++ + ± NA115 - ± + ++ + ±
Ghi chú: - Không sinh trưởng; ± Sinh trưởng yếu; + Sinh trưởng bình thường ++ Sinh trưởng tốt
Cả hai chủng ở trên đều thuộc nhóm ƣa ấm (mesophilic), cần nhiệt độ trong khoảng 20 - 40oC, không sinh trƣởng ở nhiệt độ 4oC và sinh trƣởng tốt nhất ở nhiệt độ 30oC. Nhiệt độ ảnh hƣởng mạnh đến quá trình sinh trƣởng của xạ khuẩn. Nếu nhiệt độ quá cao sẽ làm cho protein bị biến tính, thay đổi cấu hình khơng gian của enzyme và màng sinh chất bị tổn thƣơng. Nếu nhiệt độ quá thấp sẽ làm chậm hoặc bất hoạt quá trình trao đổi chất do ảnh hƣởng đến tính chất của keo nguyên sinh và ảnh hƣởng đến khả năng tạo ATP cần cho hoạt động sống của xạ khuẩn. Do đó, việc xác định nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu cho chủng là cần thiết trong q trình ni cấy.
3.3.5. Ảnh hưởng của độ pH
Rất nhiều nghiên cứu trƣớc đây đã chỉ ra rằng, pH mơi trƣờng có ý nghĩa quyết định tới sự sinh trƣởng của nhiều chủng vi sinh vật, tác động sâu sắc tới quá trình trao đổi chất của chúng. Giới hạn hoạt động của vi sinh vật thƣờng nằm trong khoảng pH từ 4 - 11. Xạ khuẩn thuộc nhóm ƣa kiềm, hầu hết sinh trƣởng tốt nhất ở pH 7 - 8, cao nhất là 11 và thấp nhất là 5.
Để xác định ảnh hƣởng của pH đến khả năng sinh trƣởng và sinh trƣởng của xạ khuẩn, chúng tôi cấy chủng xạ khuẩn trên môi trƣờng ISP2 có độ pH khác nhau, ni ở 30 - 37o
C, sau 5 - 7 ngày quan sát sự sinh trƣởng.
Bảng 3.7. Khả năng sinh trƣởng của xạ khuẩn ở các điều kiện pH khác nhau
Chủng pH
4 5 6 7 8 9 10 11
NA113 - + + ++ ++ ++ ++ +
NA115 - + ++ ++ ++ ++ ++ +
Ghi chú: - Không sinh trưởng, ± Sinh trưởng yếu, + Sinh trưởng bình thường ++ Sinh trưởng tốt
Qua bảng 3.7 ta thấy, chủng NA113 sinh trƣởng tốt ở mơi trƣờng có pH từ 7 – 10 cịn chủng NA115 sinh trƣởng tốt ở pH từ 6 - 10, cả hai chủng đều không sinh trƣởng đƣợc ở pH 4.
Hình 3.7. Khả năng sinh trƣởng của chủng NA113 trên mơi trƣờng có pH khác nhau
Hình 3.8. Khả năng sinh trƣởng của chủng NA115 trên mơi trƣờng có pH khác nhau 3.4. Kết quả phân loại chủng xạ khuẩn NA113 và NA115
3.4.1. Phân loại dựa vào đặc điểm hình thái, sinh lí-sinh hóa
Đối chiếu các đặc điểm phân loại của chủng nghiên cứu theo các khố định tên lồi xạ khuẩn của Nomomura 1976, so sánh với các đặc điểm phân loại theo khoá phân loại Gause 1983 và Bergey 1989, chúng tôi cho rằng cả hai chủng nghiên cứu có đặc điểm giống chi Streptomyces. Các đặc điểm phân loại cụ thể đƣợc trình bày ở bảng 3.8 và 3.9.
Chủng NA113 có đặc điểm giống lồi S. scabies do Waskman mô tả (1961) dạng chủng là IMRU 3018, theo phân loại ISP chủng ký hiệu là ISP 5058, nhóm B4. Chủng thuộc nhóm xám (Gy), chuỗi bào tử ngắn, xoắn, chuỗi bào tử trƣởng thành có từ 3 - 15 bào tử, bề mặt bào tử trơn nhẵn. Khuẩn ti khí sinh có màu xám trên ISP2, 3, 4, 5. Chủng khơng có khả năng sinh sắc tố melanin trên các môi
trƣờng ISP 6, 7, có khả năng sinh sắc tố tan màu vàng hoặc màu vàng sang xanh trên ISP2, 3. Mép khuẩn lạc có màu vàng, vàng nâu đến xanh ôliu, xanh nhạt, ôliu hoặc nâu ôliu trên các môi trƣờng ISP2, 3, 4, 5. Kết quả sự tƣơng đồng khi nghiên cứu các đặc điểm phân loại của chủng NA113 và chủng chuẩn ISP 5058 đƣợc thể hiện ở bảng 3.8.
Bảng 3.8. So sánh đặc điểm phân loại của chủng xạ khuẩn NA113 với chủng chuẩn
S. scabies ISP 5058 [30, 31]
Các đặc điểm NA113 ISP 5058
1. Cuống sinh bào tử Chùm 2-3 chuỗi ngắn, xoắn
móc câu (RF)
Chuỗi ngắn (RF)
2. Bề mặt bào tử và Nhẵn (Sm) Nhẵn (Sm)
3. Số bào tử/chuỗi 3 -15 3-15
4. Màu khuẩn ti khí sinh
Xám trên ISP1, 2, 3, 7 Đỏ trên ISP6 Vàng trên ISP4, 5
Xám trên ISP2, 3, 4 và 5
5. Màu khuẩn ti cơ chất
Đỏ trên ISP1, 3, 6 Xám trên ISP2, 5, 7