CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.5.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nguồn nitơ
Những hiểu biết về thành phần môi trƣờng lên men (nồng độ nguồn cacbon, nitơ, photphat vơ cơ, các chất kích thích hoặc kìm hãm sinh tổng hợp chất kháng sinh) cũng nhƣ ảnh hƣởng của các điều kiện nuôi cấy khác (nhƣ pH, nhiệt độ, độ thơng khí, đặc điểm của chủng giống) có ý nghĩa to lớn trong điều khiển q trình lên men nhằm duy trì trạng thái hoạt động và có thể kéo dài pha sinh tổng hợp của chủng sản xuất. Trên cơ sở các môi trƣờng lên men đã lựa chọn đƣợc, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của nguồn cacbon và nitơ tới khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của các chủng xạ khuẩn. Chủng vi sinh vật kiểm định sử dụng trong các thí nghiệm là B. subtilis ATCC 6630.
Bảng 3.13. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon và nitơ đến hoạt tính kháng khuẩn của
chủng NA113 và NA115
Khả năng sinh trƣởng và sinh chất kháng khuẩn (D-d, mm)
Nguồn cacbon NA113 NA115
Glucose ++ 18 ++ 17 Maltose + 21 + 20 Tinh bột ++ 23 ++ 24 Dextrose + 19 + 20 Saccarose + 20 + 19 Nguồn nitơ NH4Cl ± 10 - 0 (NH4)2SO4 - 0 - 0 Yeast extract + 20 ++ 21 Casein ++ 23 ++ 20 Pepton + 19 ++ 25 Trypton + 19 ++ 21 Cao ngô ± 11 ± 9 Bột đâu tƣơng ++ 23 ++ 23 Khô lạc ± 10 ± 10 Malt extract ± 10 ± 9
Ghi chú:+ Sinh trưởng bình thường; - Khơng sinh trưởng; ± Sinh trưởng yếu; ++ Sinh trưởng tốt
Kết quả cho thấy chủng xạ khuẩn NA113 triển tốt trên mơi trƣờng có nguồn cacbon là tinh bột, glucose. Nguồn cacbon tốt nhất để tạo chất kháng sinh là tinh bột với vòng kháng khuẩn là 23 mm và hoạt tính kháng sinh kém nhất khi sử dụng nguồn cacbon là glucose với vòng kháng khuẩn là 18 mm. Bột đậu tƣơng và casein là nguồn nitơ thích hợp nhất cho sinh trƣởng và tổng hợp chất kháng sinh của chủng NA113 với vịng kháng khuẩn 23 mm. Trên mơi trƣờng nitơ vô cơ, chủng này sinh trƣởng yếu và hoạt tính kháng sinh yếu hoặc khơng có.
Tinh bột là nguồn cacbon thích hợp nhất cho sinh trƣởng và tổng hợp chất kháng sinh của chủng NA115 (VKK là 24 mm); nguồn nitơ thích hợp nhất là pepton
với vòng kháng khuẩn 25 mm. Chủng này không sinh trƣởng trên mơi trƣờng có nitơ vơ cơ.
3.5.3. Ảnh hưởng của pH môi trường và độ thống khí
Độ thống khí và pH ban đầu có vai trị quan trọng trong q trình tạo chất kháng sinh. Chủng xạ khuẩn đƣợc nuôi trên môi trƣờng lên men đã lựa chọn ở trên, với pH khác nhau (từ 5 - 9). Để xác định ảnh hƣởng của độ thống khí tới sinh tổng hợp chất kháng sinh, chúng tơi thay đổi thể tích dịch ni trong bình có dung tích 500ml để ơxi có thể khuếch tán vào trong, từ đó xác định đƣợc thể tích mơi trƣờng ni cấy thích hợp nhất.
Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của pH ban đầu và độ thống khí đến đến hoạt tính kháng
khuẩn của chủng NA113 và NA115
pH NA113 NA115 5 15 13 6 22 19 7 28 27 8 20 15 9 15 11 Độ thống khí (%, v/v) 10 15 13 15 22 19 20 28 27 25 26 27 30 15 19
Kết quả cho thấy cả hai chủng đều có hoạt tính kháng sinh mạnh nhất khi mơi trƣờng có pH 7, chủng NA113 có hoạt tính kháng B. subtilis ATCC6633 với
đƣờng kính vịng kháng khuẩn 28 mm và vịng kháng khuẩn của chủng NA115 là 27 mm.
Thể tích mơi trƣờng chiếm 20 – 25% thể tích bình ni cho hiệu quả tổng hợp chất kháng sinh cao nhất. Chủng NA113 có vịng kháng khuẩn 28 mm khi có lƣợng dịch mơi trƣờng chiếm 20% và 26 mm với lƣợng dịch môi trƣờng chiếm 25%
thể tích bình. Chủng NA115 có hoạt tính mạnh nhất khi lƣợng dịch nuôi chiếm 20 – 25% thể tích bình lên men với vịng kháng khuẩn là 27 mm.
3.6. Phổ hoạt tính kháng sinh của 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu
Kiểm tra phổ kháng sinh của 2 chủng xạ khuẩn NA113 và NA115 cho thấy, dịch chiết sinh khối hồn tồn khơng ức chế các vi sinh vật kiểm định, chứng tỏ các chủng xạ khuẩn đã sinh tổng hợp chất kháng sinh và tiết vào môi trƣờng nuôi cấy. Dịch chiết từ dịch lên men của 2 chủng xạ khuẩn đều có hoạt tính kháng các vi sinh vật kiểm định ở mức độ khác nhau.
Cả hai chủng NA113 và NA115 đều sinh chất kháng sinh kháng đƣợc nhiều chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm B. subtilis ATCC 6633, B. cereus ATCC
21778, S. epidermidis ATCC 12228, S. typhi IFO14193, E. coli ATCC 11105 và C.
albicans ATCC 10321; trong khi đó khơng kháng đƣợc 2 chủng vi sinh vật kiểm
định là A. faecallis và P. auroginosa. Với vi sinh vật kiểm định là E. aerogenes
ATCC 13048 chỉ có chủng NA113 kháng đƣợc với vịng kháng khuẩn 13 mm. Kết quả thu đƣợc về phổ kháng khuẩn của 2 chủng xạ khuẩn S. scabies NA113 và S. tendae NA115 mở ra tiềm năng ứng dụng sản xuất thuốc dùng trong y dƣợc.
Bảng 3.15. Phổ kháng khuẩn của 2 chủng xạ khuẩn S. scabies NA113
và S. tandae NA115
Chủng vi sinh vật kiểm định Đƣờng kính vịng đối kháng (mm)
NA113 NA115 B. subtilis ATCC 6633 25 24 B. cereus ATCC 21778 14 21 S. epidermidis ATCC 12228 26 22 E. coli ATCC 11105 22 17 E. aerogenes ATCC 13048 13 - A. faecallis - - S. typhi IFO 14193 15 19 P. auroginosa - - C. albicans ATCC 10231 9 15
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Từ các mẫu đất, nƣớc, bùn thu thập từ các vùng biển Hải Phòng, Quảng Ninh và Nghệ An đã phân lập đƣợc 40 chủng xạ khuẩn, trong đó 30 chủng có khả năng sinh chất kháng sinh. Chủng NA113 và NA115 có hoạt tính kháng sinh cao đƣợc chọn tiếp tục nghiên cứu
2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học, kết hợp giải trình tự gene mã hóa 16S- rRNA, đã phân loại đƣợc chủng NA113 thuộc loài S. scabies và đặt tên là S. scabies NA113. Chủng có khả năng sinh trƣởng tốt với nguồn nitơ hữu cơ nhƣ cao nấm men, trypton, pepton. pH thích hợp từ 7 – 10. Chủng sinh trƣởng tốt ở nồng độ NaCl từ 1 – 5% và nhiệt độ 30o
C.
3. Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa và giải trình tự gene 16S- rRNA, đã phân loại đƣợc chủng NA115 thuộc loài S. tendae và đặt tên là S. tandae NA115. Chủng thích hợp với pH 6 – 10, nồng độ NaCl 1 – 3% và nhiệt độ 30oC.
4. Hai chủng S. scabies NA113 và S. tendae NA115 đều có khả năng kháng
lại 6 chủng vi sinh vật kiểm định là B. subtilis ATCC 6633, B. cereus ATCC 11778,
S. epidemidis ATCC 12228, C. albicans ATCC 10231. E. coli ATCC 11105, S. typhi IFO 14193. Ngoài ra chủng NA113 còn kháng đƣợc vi khuẩn E. aerogenes
ATCC 13048.
5. Mơi trƣờng thích hợp để chủng NA113 sinh chất kháng sinh là môi trƣờng MT7; pH 7 và thể tích mơi trƣờng ni cấy chiếm 20% thể tích bình. Trong khi đó mơi trƣờng thích hợp cho chủng NA115 là M1-ASW; pH 7 và thể tích mơi trƣờng ni cấy chiếm 20 – 25% thể tích bình là thích hợp nhất cho q trình lên men.
ĐỀ NGHỊ
1. Khảo sát các điều kiện lên men thích hợp cho tổng hợp chất kháng sinh. 2. Nghiên cứu tách chiết các chất kháng sinh từ 2 chủng xạ khuẩn biển S. scabies NA113 và S. tendae NA115, thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ của các
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Ngơ Đình Quang Bính (2005), Vi sinh vật học cơng nghiệp – các chất kháng
sinh. Viện Khoa học Việt Nam, Hà Nội.
2. Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mƣợu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học – tập 1, NXB KH và KT, Hà Nội.
3. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lƣơng, Đồn Xn Mƣợu, Phạm Văn Ty (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học - tập 3, NXB KH và KT, Hà Nội.
4. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2001), Vi sinh vật
học, NXB Giáo dục, Hà Nội.
5. Nguyễn Thành Đạt (2005), Cơ sở sinh học vi sinh vật, tập 1, NXB ĐHSP, Hà Nội.
6. Nguyễn Nhƣ Hiền (2006), Giáo trình Sinh học tế bào, NXB Giáo Dục, Hà
Nội.
7. Lê Gia Hy (1994), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn và thối rễ phân lập ở Việt Nam,
Luận án phó tiến sĩ khoa học Sinh học, viện CNSH, Trung tâm KHTN và CN Quốc Gia, Hà Nội.
8. Lê Gia Hy và cs (2005), “Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn biển HT0523”, Những vấn đề cơ bản trong nghiên cứu khoa học sự
sống định hướng y học, 549-552, NXB KHKT, Hà Nội.
9. Bùi Minh Lý, Ngô Quyền Bƣu, Nguyễn Duy Nhứt, Phạm Đức Thịnh, Trần Thị Thanh Vân (2007), “Nghiên cứu sản xuất Fucoidan từ rong nâu Việt Nam”, Tuyển tập các báo cáo khoa học, Hội nghị khoa học Biển Đông.
10. Chu Văn Mẫn (2011), Tin học trong Công nghệ Sinh học, NXB Giáo Dục
Việt Nam, Hà Nội.
11. Nguyễn Phƣơng Nhuệ (2010), Nghiên cứu quy trình lên men sản xuất kháng
sinh vancomycin từ xạ khuẩn Streptomyces orientalis 4912, Luận án tiến sĩ
Sinh học, viện CNSH, viện KH và CN Việt Nam, Hà Nội.
12. Nguyễn Duy Nhứt và cộng sự, (2009), “Bƣớc đầu nghiên cứu tính kháng khuẩn của một số lồi rong biển Khánh Hịa”, Hội nghị Cơng nghệ sinh học
toàn quốc, 825- 830.
13. Nguyễn Xuân Thành, Nguyễn Bá Hiên, Hồng Hải, Vũ Thị Hoan (2005), Vi
sinh vật cơng nghiệp, NXB Giáo dục, Hà Nội.
TIẾNG ANH
14. Carlos O., Carmen M., José A. S. (2009), “Antitumor Compounds from Marine Actinomycetes”, Marine Drugs, 7, 210-248.
15. Demain A. L. (1981), Industrial Microbiology, Science 214, 987 – 995. 16. George P. R. (2008), Encyclopedia of Genetics, Genomics, Proteomics and
Informatics, 3rd, Springer, 1709 – 1712.
17. Isoken Nekpen Henrietta Ogunmwonyi (2010), Assessment of antibiotic production by some marine Streptomyces isolated from the Nahoon beach,
Master of Science in Microbiology, Department of biochemistry and microbiology faculty of science and agriculture, University of for Hare, Alice, South Africa.
18. James B. M., Arjun H. B., Romila D. C., Gerhard S., Emmanuel Z., Mahmood P., Jeffrey J., Valerie S. B., Mustapha A., Chris M. F., Xidong F., Zhizi Z., Guy T. C. (2008), “Biosynthesis of Diazepinomicin/ECO-4601, a Micromonospora Secondary Metabolite with a novel ring system”; J. Nat. Prod, 71, 1585-1590.
19. Jin Xiong (2006), Essential Bioinformatics, Cambridge University press,
New York.
20. Kamerua Masahiro and Moris Kates (1999), “Structural diversity of membrane lipits in member of Halobacteriaceae”, Bioscience Biotechnology Biochem, 63(6), 969-972.
21. Keswanit J. and Whitman W.B. (2001), “Relationship of 16S rRNA sequence similarity to DNA hybridization in prokaryotes”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 51, 667 – 678.
22. Kin S Lam (2006), “Discovery of novel metabolites from marine actinomycetes”, Current Opinion in Microbiology, 245-251.
23. Krishnaraj M., Mathivanan N. (2009), “Antimicrobial potential of marine actinomycetes isolated from the Bay of Bengal” Envis centre newsletter, vol 7, issue 3.
24. Nor Ainy Mahyudin (2008), “Actinomycetes and Fungi associated with marine Invertebrates: A potential source of bioactive compounds”, Doctor of Philosophy in Microbiology at the University of Canterbury, New Zealand. 25. Paul R. Jensen, Dwight R., and Fenical W. (1991), “Distribution of
Actinomycetes in Near-Shore Tropical Marine Sediments”, Applied and
Environmental Microbiology, Vol. 57, No. 4, 1102-1108.
26. Paul R. Jensen, Tracy J. Mincer, Philip G. Williams, William Fenical (2005), “Marine actinomycete diversity and natural product discovery”,
Antonie van Leeuwenhoek, 43-48.
27. Robert S., E. G. D. Murray, Nathan R. (1957), Bergey’s Mannual of determinative bacteriology, 7th, Williams & Wilkins, 744-822.
28. Rofiq Sunaryanto, Bambang Marwoto (2010), “Marine actinomycetes screening of Banten west coast and their antibiotics purification”
29. Sambrook J. and Rusell W.D. (2001), Molecular cloning – Laboratory manual, vol 2, 3nd, pp 8.4 – 8.25, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Newyork.
30. Shirling E.B., Gottlieb D. (1966) International of systematic bacteriology: Method for characterization of Streptomyces species. Derpartment of Botany
and Bacteriology Ohio Wesleyan University, Delaware, Ohio and Derpartment of Plant Pathology University of Illinois, Urbana, Illinois.
31. Stanley T. Williams et al. (1989), Bergey’s Mannual® of Systematic Bacteriology. Williams & Wilkins Vol. 4, 2452-2492.
32. Sumei Li, Xinpeng Tian, Siwen Niu, Wenjun Zhang, Yuchan Chen, Haibo Zhang, Xianwen Yang, Weimin Zhang, Wenjun Li, Si Zhang, Jianhua Ju, Chángheng Zhang (2011) “Pseudonocardians A-C, New diazaanthraquinone derivatives from a deap-sea actinomycete Pseudonocardia sp. SCSIO 01299”
Marine Drugs, 9, 1428-1439.
33. Turk biol (2003), Investigaion of the Antimicrobial Activity of some Streptomyces Isolates, No 27, 79-84.
34. Valli S, Suvathi Sugasini S, Aysha OS, Nirmala P, Vinith Kumar P và Reena A (2012), “Antimicrobial potential of actinomycetes species isolated from marine environment”, Asian Pacific Journal og Tropical Biomedicine,
469-473.
35. Vijaya Baskara Sethubathi G. and Ashok Prabu V. (2010), “Antibacterial activity of Cyanobacterial species from Adirampattinam coast southeast coast of Palk bay”, Current research Journal of Biological Sciences 2(1), 24- 26.
36. Waksman, S.A. (1961), “Classification, identification and description of genera and species”, The Actinomycetes, vol 2, The Williams and Wilkins
PHỤ LỤC 1: VỊ TRÍ LẤY MẪU VÙNG VEN BIỂN
STT
Ký hiệu
mẫu Mẫu và vị trí lấy mẫu Địa điểm Số mẫu
1 HLN1 Mẫu nƣớc mặt sâu 50cm tại Hạ Long Quảng Ninh 2
2 HLN2 Mẫu nƣớc mặt sâu 1 m tại vịnh Hạ Long Quảng Ninh 3
3 HLN3 Mẫu nƣớc mặt sâu 50cm ven đảo trên vịnh
Hạ Long
Quảng Ninh 2
4 HLN4 Mẫu nƣớc biển xa bờ trong vịnh Hạ Long Quảng Ninh 2
5 HLB1 Mẫu bùn đất tại đảo trên vịnh Hạ Long Quảng Ninh 6
6 HLB2 Mẫu bùn đất tại đảo trên vịnh Hạ Long Quảng Ninh 1
7 HLB3 Mẫu đất ven bờ đảo tại vịnh Hạ Long Quảng Ninh 1
8 HLC1 Mẫu đất ven bờ đảo tại vịnh Hạ Long Quảng Ninh 2
9 HLC2 Mẫu đất cát ven bờ đảo tại vịnh Hạ Long Quảng Ninh 1
10 VD1 Mẫu nƣớc mặt xa bờ tại Vân Đồn Quảng Ninh 2
11 VD2 Mẫu nƣớc ven bờ tại Vân Đồn Quảng Ninh 2
12 VD3 Mẫu đất bùn xa bờ tại Vân Đồn Quảng Ninh 2
13 VD4 Mẫu cát ven bờ tại Vân Đồn Quảng Ninh 2
14 HLS1 Mẫu cát sỏi tại vịnh Hạ Long Quảng Ninh 2
15 HLS2 Mẫu cát sỏi tại vịnh Hạ Long Quảng Ninh 2
16 BB1 Mẫu bọt biển tại ven đảo thuộc vịnh Hạ
Long
Quảng Ninh 2
17 HPB4 Mẫu đất bùn tại bãi rừng ngập mặn ở Cát Bà Hải Phòng 2
18 HPB5 Mẫu đất bùn tại bãi rừng ngập mặn ở Cát Bà Hải Phòng 1
19 HPN5 Mẫu nƣớc ven bờ đảo tại đảo Cát Bà Hải Phòng 2
20 HPN6 Mẫu nƣớc xa bờ tại đảo Cát Bà Hải Phòng 2
21 HPC3 Mẫu nƣớc tại chân đê biển Ngọc Hải, Đồ
Sơn
Hải Phòng
2
22 HPC4 Mẫu đất bùn tại chân đê biển Ngọc Hải, Đồ
Sơn
Hải Phòng
2
23 IM1 Mẫu bọt biển tại Cát Bà Hải Phòng 2
24 IM2 Mẫu bùn tại rừng ngập mặn nằm cạnh đê
biển Ngọc Hải
Hải Phòng
2
25 IM3 Mẫu nƣớc tại rừng ngập mặn nằm cạnh đê
biển Ngọc Hải
Hải Phòng
2
26 IM4 Mẫu nƣớc và lá cây tại rừng ngập mặn nằm
cạnh đê biển Ngọc Hải
Hải Phòng
1
28 IM6 Mẫu đất ven bờ tại đảo Hòn Dáu, Đồ Sơn Hải Phòng 2
29 CBD1 Mẫu nƣớc ven bờ đảo Cát Bà Hải Phòng 2
30 CBD2 Mẫu nƣớc xa bờ đảo Cát Bà Hải Phòng 2
31 CBD3 Mẫu đất sỏi ven bờ đảo Cát Bà Hải Phòng 2
32 CBS3 Mẫu đất sỏi ven bờ đảo Cát Bà Hải Phòng 2
33 VK1-2 Mẫu nƣớc và lá cây tại rừng ngập mặn nằm
cạnh đê biển Ngọc Hải
Hải Phòng
2 34
VK2-2 Mẫu nƣớc và lá cây tại rừng ngập mặn nằm
cạnh đê biển Ngọc Hải
Hải Phòng
1
35 VK3-1 Mẫu nƣớc và lá cây tại rừng ngập mặn nằm
cạnh đê biển Ngọc Hải
Hải Phòng
1
36 VK4-1 Mẫu nƣớc và lá cây tại rừng ngập mặn nằm
cạnh đê biển Ngọc Hải
Hải Phòng
2
37 NA1 Mẫu nƣớc mặt xa bờ tại Diễm Châu, Cửa
Lò
Nghệ An
2
38 NA2 Mẫu nƣớc mặt ven bờ tại Diễm Châu, Cửa
Lò
Nghệ An
2
39 VK1-1 Mẫu đất, bùn ven bờ tại Diễm Châu, Cửa
Lò
Nghệ An