Chương 2 : Thực nghiệm
2.4. Quy trình thử nghiệm
2.4.1 Xây dựng đường chuẩn
- Pha dung dịch chuẩn gốc : Chuyển 1 mL dung dịch mix OCP-Mix 20 nồng độ 2000 μg/mL vào bình định mức 50, định mức đến vạch bằng dung môi n-hexan, ta được dung dịch chuẩn OCP 40 μg/mL (ppm). Bảo quản dung dịch trong bình tối màu và lưu trữ trong tủ lạnh -20ºC.
- Tiến hành xây dựng đường chuẩn: Đường chuẩn các hợp chất OCPs được xây dựng gồm 6 điểm chuẩn ở các mức nồng độ tăng dần trong khoảng 10 đến 500 ppb. Cách pha được nêu trong bảng 2.2
Bảng 2. 2. Cách pha điểm chuẩn xây dựng đường chuẩn
Nồng độ (ppb) 1000 10 20 50 100 200 500 Thể tích hút (µL) Chuẩn OCPs 1ppm - 10 20 50 100 - - Chuẩn OCPs 10ppm 100 - - - - 20 50 Định mức (mL) 1 1 1 1 1 1 1
2.4.2. Khảo sát tối ưu hóa các điều kiện phân tích trên thiết bị GC/MS
a) Sử dụng phương pháp quy hoạch hóa thực nghiệm khảo sát điều kiện tối ưu trên thiết bị GC/MS
Hiện nay, các nhà nghiên cứu khảo sát các điều kiện phân tích để tối ưu hóa vẫn chỉ chủ yếu tiến hành theo phương pháp đơn biến, nghĩa là thay đổi một yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phân tích và giữ cố định các yếu tố khác. Điều này sẽ mất rất nhiều thời gian, và gây khó khăn trong việc sắp xếp các thí nghiệm. Trong khi phương pháp qui hoạch hóa thực nghiệm (design of experiment – DOE) ngày càng phổ biến, dễ sử dụng và áp dụng rất tốt vào việc khảo sát điều kiện tối ưu cho các phương pháp phân tích.
Tiến hành qui hoạch hóa thực nghiệm trên chất chuẩn mix 20 OCPs 1 ppm với các thông số là nhiệt độ cổng tiêm, nhiệt độ nhiệt độ bộ phận kết nối GC và MS
30
và tốc độ dịng khí mang. Các điểm mốc khảo sát nhiệt độ cổng bơm mẫu là 200, 230, 260oC; nhiệt độ bộ phận kết nối GC và MS 260, 280, 300oC. Tốc độ dịng khí thay đổi với các giá trị 1,0; 1,4; 1,8 mL/phút. Tiến hành thí nghiệm với các điểm nút và các điểm trung tâm, tổng số thí nghiệm được thực hiện là 11 thí nghiệm. Kết quả được tập hợp phân tích bằng phần mềm Minitab 16.
b) Khảo sát, tối ưu hóa tốc độ khí mang phân tích hóa chất BVTV cơ clo trên GC/MS
Tốc độ dòng và áp suất trên cột là những đại lượng ảnh hưởng đến độ phân giải của chất phân tích theo phương trình Van-Deemter. Sự thay đổi tốc độ dòng sẽ làm thay đổi áp suất, thời gian lưu và bề rộng đáy của mũi sắc ký. Tốc độ dòng nhỏ sẽ làm tăng thời gian lưu đồng thời làm rộng đáy của pic sắc ký. Tốc độ dòng lớn sẽ làm tăng áp suất và do đó làm giảm tuổi thọ cột. Do đó việc khảo sát tốc độ dịng khí mang và áp suất vào cột là rất quan trọng, việc khảo sát tốc độ dịng khí mang được tiến hành với từng nhóm chất khác nhau. Dựa trên sắc ký đồ sẽ nhận xét về sự cân đối của các pic và khả năng tách giữa các pic được tính theo độ phân giải theo cơng thức dưới đây.
1 2 1 2 * 2 W W t t R R R [8] Trong đó:
tR2 và tR1: lần lượt là thời gian lưu của pic 2 (pic sau) và pic 1 (pic trước) W2 và W1: chiều rộng chân pic 2 và chân pic 1
Để tiếp tục đánh giá ảnh hưởng của tốc độ khí mang đến kết quả phân tích, tiến hành thực nghiệm với chất chuẩn OCPs mix 1ppm và thay đổi tốc độ khí mang là 1,0; 1,2; 1,4; 1,6 và 1,8 mL/phút. Tốc độ dòng tối ưu được lựa chọn dựa trên độ phân giải peak.
c) Khảo sát thể tích bơm mẫu
Cột tách sử dụng trong sắc ký khí là cột mao quản có đường kính nhỏ vì vậy dung tải của cột có giới hạn nhất định, việc bơm mẫu với nồng độ lớn có thể gây quá tải cột, gây nhiễm chéo các mẫu phân tích. Vì vậy cần phải khảo
31
sát thể tích bơm mẫu để xác định giới hạn tuyến tính của thiết bị cũng như đảm bảo giới hạn phát hiện để phân tích các hợp chất OCPs
d) Kiểm tra chuẩn mix thông qua các chuẩn đơn
Hỗn hợp chất chuẩn bao gồm nhiều cấu tử và được sử dụng thường xuyên. Theo định kỳ cần kiểm tra lại chuẩn mix theo các chuẩn đơn để bảo đảm tồn bộ các chất đều có nồng độ chính xác trong q trình sử dụng. Để đảm bảo tính khách quan và độ chính xác cao nhóm nghiên cứu tiến hành phân tích các chuẩn đơn Gama-BHC, Aldrin, Methoxylchlor, Endosunfan1 và hỗn hợp chất chuẩn gồm 20 hợp chất OCP có nồng độ 500ppb trong cùng một điều kiện phân tích và lặp lại 10 lần. Kết quả đánh giá dựa trên việc so sánh diện tích trung bình của các peak thu được của 4 hợp chất Gamma BHC, Aldrin, Endosunfan 1 và Methoxychlor giữa chuẩn mix và chuẩn đơn
2.4.3. Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu
a) Khảo sát số lần chiết lặp đối với nền mẫu nước
Hiệu suất chiết tăng tỷ lệ với số lần chiết lặp, tuy nhiên cũng kèm theo việc tốn dung mơi, thời gian và chi phí phân tích. Để tìm được số lần chiết lặp tối ưu, vừa đảm bảo hiệu suất cao nhưng vẫn tiết kiệm được chi phí và thời gian phân tích, tiến hành chiết lặp 3 lần mẫu trắng thêm chuẩn nồng độ OCPs 100 ppb; mỗi lần 30 mL dung môi diclomethane
b) Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện bay hơi dung mơi bằng khí nitơ
Trong q trình xử lý mẫu, dung môi để chiết tách là diclomethane, để phù hợp với cột tách DB-5MS cần chuyển dung mơi phân tích sang hexane. Việc chuyển đổi dung mơi cần có các khảo sát để hạn chế thấp nhất việc làm mất chất phân tích. Sau khi làm bay dung mơi bằng thiết bị cô quay chân không chúng tôi chuyển dung mơi hexane và chuyển sang thổi khí nitơ đến dưới 1 mL và chuyển sang bình định mức, định mức tới 1 mL bằng hexane. Nhiệt độ khảo sát là 25oC và 5oC.
c) Khảo sát thời gian chiết siêu âm đối với nền mẫu đất
32
Cân khoảng 5 gam mẫu đất, chuyển vào ống vial thủy tinh 20 mL, thêm 10 mL dung môi diclomethane, đóng kín bằng nắp cao su và đưa vào bể rung siêu âm. Dịch chiết được lọc qua màng lọc 0,45µm và chuyển 5 mL qua ống thổi nitơ Quá trình rung siêu âm làm tăng nhiệt độ bể rung và dung mơi trong mẫu nên việc kiểm sốt nhiệt độ rung siêu âm là rất khó. Tuy nhiên việc sử dụng ống vial 20 mL đã được đóng kín hạn chế được việc dung mơi bốc hơi làm thất thốt mẫu.Thời gian rung siêu âm khảo sát từ 10÷70 phút
d) Khảo sát thể tích dịch chiết chuyển qua kit làm sạch
Phương pháp QuEChERS sử dụng trong nghiên cứu này được tham khảo ở tài liệu AOAC 2007.01 [22], sử dụng các bộ kit có sẵn do nhà sản xuất khuyên dùng. Tuy nhiên để phù hợp với các điều kiện phân tích thực tế có ở phịng thí nghiệm, và do lượng bột làm sạch đã được cố định nên cần khảo sát thể tích dịch chiết ở bước chiết từ lúc đầu để có thể đạt được hiệu quả làm sạch tốt nhất mà hiệu suất thu hồi là cao nhất.Thể tích dịch chiết khảo sát từ 5÷12 mL
Hình 2.2 Bột làm sạch và kit làm sạch
33
2.4.4 Đánh giá phương pháp
- Thí nghiệm xác định MDL và MQL: Thêm chuẩn nồng độ OCPs 10ppb đối với mẫu đất; chè và 20 ppt đối với mẫu nước tiến hành xử lý mẫu theo quy trình; đo lặp 10 lần để xác định MDL và MQL .
- Thí nghiệm xác định độ thu hồi: Tiến hành trên nền mẫu thực thêm chuẩn OCPs với nồng độ 100 ppb. Dựa vào đường chuẩn để tính tốn nồng độ thu được từ đó xác định độ thu hồi của phương pháp nghiên cứu.
- Thí nghiệm xác định độ lặp lại: Tiến hành thêm chuẩn 10 ppb với nền mẫu đất; chè và 20 ppt đối với nền mẫu nước đo lặp lại 10 lần mẫu vừa xử lý, kết quả thu được xác định độ lặp lại.
- Thí nghiệm xác định độ tái lặp: Tiến hành thí nghiệm lặp lại giữ nguyên các yếu tố phân tích, tiến hành thay đổi ngày phân tích trên cùng một nền mẫu. Kết quả của 2 lần phân tích dùng để xác định độ tái lặp.