1.4.1.Tình hình nghiên cứu cây Lan huệ trên thế giới
Seabrook và cs(1976) đã phát hiện một kỹ thuật mới cho việc phát triển các
dòng Lan huệ (Hippeasrum sp.) bằng nuôi cấy mô [36]. Từ các bộ phận của cây như
lá, bên trong các vảy củ và nỗn có thể được ni cấy thành cơng trong ống nghiệm và cây con dễ dàng phát sinh ở các nồng độ chất điều tiết sinh trưởng khác nhau. Thậm chí một số cây con cũng phát sinh trong trường hợp khơng có chất điều tiết sinh trưởng. Cây con cũng cảm ứng phát sinh rễ ngay vào trong môi trường cơ bản mà không cần tới chất đặc biệt nào.
Hussey(1975) cũng đã nghiên cứu nhân giống in vitrotrên một số giống cây trong đó có Hippeastrum, ơng chỉ ra rằng có thể nhân in vitrotrên quy mơ củ và thân
cây đối với những cây thuộc chi này [23].
Khi lai các giống cây thuộc chi Hippeastrum có thể có được cây con ra hoa
sau 2-3 năm, hoặc lâu hơn là từ 4-7 năm. Những nghiên cứu cơ bản đã được tiến
hành giúp xác định được NST đơn bội của các loài trong chi Hippeastrum là n=11.
Hầu hết các lồi đều có bộ NST lưỡng bội 2n=22, tuy nhiên người ta cũng bắt gặp một số lồi có bộ NST tam bội, tứ bội, thậm chí là ngũ bội [5].
Đối với các cây thuộc họ Liliaceae, khi sử dụng phương pháp nhân giông in-
vitro thì yếu tơ ảnh hưỏng quyết định đến hiệu quả nhân giống là loại vật liệu sử
dụng ban đầu.Rất nhiều loại vật liệu đã được sử dụng trong các nghiên cứu như vảy củ khơng dính đế củ [25,35], phần đế củ mang một vảy củ và phần đế củ mang 2 vảy củ [18], phần đế củ không mang vảy củ [16], các bộ phận của hoa như cuống
hoa [35], chồi in-vivo hoặc củ in-vitro nhỏ [18, 23]...
dụng các loại vật liệu nuôi cấy khác nhau. De Bruyn và cộng sự(1992) sử dụng phần đế củ có kích thước 4 mm mang 2 vảy củ kích thước là 25 mm x 10 mm để nuôi cấy cho tỷ lệ mẫu tái sinh đạt 80% cao hơn rất nhiều so với mẫu cấy đế củ không mang vảy củ, gần như khơng có mẫu tái sinh [18]. Năm 1993, Slabbert và
cộng sự nuôi cấy phần đế củ mang 2 vảy củ (twin scales) cây Curinum macowanii (thuộc họ Liliaceae) trên mơi trường MS có bổ sung 0,1 mg/l α-NAAvà 0,1 mg/l
Kinetin đã thu được 700 - 1000 chồi từ 1 mẫu cấy ban đầu sau 12 tháng nuôi cấy, trong khi nếu sử dụng các bộ phận của hoa thì thu đươc chỉ là 100 chồi [38]. Rất nhiều các nghiên cứu khác cũng đã khẳng định phần đế củ mang 2 vảy củ cho kết quả nhân tốt nhất [25,35].
Các nghiên cứu cho thấy hệ sô nhân từ chồi in vitro của cây Lan huệ chưa
cao. Thực tế đây cũng là khó khăn mà rất nhiều nghiên cứu nhân giống trên chi
Hippeastrum nói chung và trên đối tượng này nói riêng đã gặp phải. Janet và cộng
sự năm 1977 đã sử dụng callus làm vật liệu nhân nhanh cây Hippeastrumspp. và đã
thu được hệ số nhân 10 chồi/mẫu cấy sau 8 tuần nuôi cấy [35]. Tiếp theo đó,
O’Rourke và cs. (1991) sử dụng củ nhỏ in vitro làm vật liệu nhân nhanh cây
Hippeastrum hybridum "Apple Blossom” và hệ số nhân thu được đã tăng lên 100
chồi/củ ban đầu sau 26 - 28 tuần nuôi cấy [32].Do vậy cần phải sử dụng các nguồn
vật liệu nhân giống in vitro khác nhau, đồng thời cải thiện môi trường nhân thích
hợp để nâng cao hệ số nhân nhanh cây Lan huệ.
Tadashi và cộng sự (1995) đã tiến hành nhân giống in vitro củ và củ sạch bệnh bằng nuôi cấy vảy củ Hippeastrum hybridum. Trên môi trường White’s (1943)
agar có bổ sung 0,01 mg/l α-NAA và 5,0 mg/l BA thích ứng tối ưu cho vảy củ ni
cấy được cắt với kích thước 2mm. Sự hình thành củ in vitro tối ưu từ vật liệu nuôi
cấy là vảy củ trên môi trường White lỏng lắc. Hầu hết các củ thu được đều sạch virus CMV, 33% sạch virus HiMV. Tất cả các củ mới thu được từ củ nuôi cấy đều sạch cả 2 loại virus [40].
Nghiên cứu thiết lập hệ thống vườn ươm tạo cây hoàn chỉnh từ cây và củ
Cây ra rễ phát triển tốt nhất trên môi trường MS bổ sung 0,2 mg/l α-NAA. Cây và củ có sức sống tốt nhất, có số lá nhiều nhất, đạt chiều cao cây tốt nhất khi trồng trên giá thể đất, cát và phân (1:1:1) [37].
Sultanavà cộng sự (2010)đã nghiên cứu tạo củ in vitrocủa Hippeastrum
hybridum. Nghiên cứu trên mơi trường MS có bổ sung BAP và CCC (Chioro
Choline Chloride) và nồng độ đường khác nhau. Ở 90 g/l đường đạt khối lượng củ nặng nhất cũng như tỷ lệ tái sinh cao nhất. Tăng tỷ lệ CCC làm tăng số lượng và khối lượng củ. Sự hình thành củ đạt tối đa trên môi trường bổ sung 6 mg/l BAP và 500 mg/l CCC với 90g/l đường [39].
Behzad và cộng sự (2012) đã nghiên cứu ảnh hưởng của chiếu sáng (16/8, 14/10, và 12/12 h ánh sáng / tối), nồng độ khác nhau của α-NAA (0, 1, 2, và 4 mg/
l) và 2iP (0, 14, 16, và 18 mg/l) trong nhân giống Hippeastrum johnsonii sử dụng củ
nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản. Mơi trường MS có bổ sung 16 mg/l 2iP + 4,0 mg/l α-NAA, thời gian chiếu sáng 16/8 h (chiếu sáng/ tối) được xác định là hiệu quả nhất[15].
Nghiên cứu của Sara và cộng sự (2013) chỉ ra rằng sự hình thành rễ in vitro của Hippeastrum johnsonii dưới ảnh hưởng của 2-iP và α-NAA. Trên môi trường
MS + 16 mg/l 2-iP + 4,0 mg/l α-NAA là tối ưu cho sự hình thành rễ của củ. Chiều dài cao nhất của rễ đạt 2,71 cm, rễ dài nhất đạt 3,53 cm và số rễ đạt 2,77 cm trên môi trường bổ sung 4,0 mg/l α-NAA. Cây ra rễ sống sót 90% trên giá thể chứa xơ dừa, phân và cát [34].
1.4.2.Tình hình nghiên cứu cây Lan huệ ở Việt Nam
Khả năng thành công của nuôi cấy mô tế bào phụ thuộc chủ yếu vào trạng thái tuổi của tế bào. Tế bào càng gần trạng thái phôi sinh bao nhiêu, khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu. Như vậy tế bào phơi thường có triển vọng nhất rồi đến tế bào các đỉnh sinh trưởng đang ở trạng thái hoạt động (đỉnh ngọn, chóp rễ) và sau đó là tế bào ở trạng thái ngủ nghỉ (chồi nách)[17,18,20].
Sau khi có củ mẹ, ta cắt củ mẹ thành nhiều mảnh nhỏ (đế củ mang hai vảy củ) rồi trồng vảy củ xuống nền giá thể thích hợp. Sau đó ni trồng 2 tháng thấy
trên vảy củ xuất hiện chồi và củ nhỏ. Các chồi và củ nhỏ này được nuôi trong 2 – 3 vụ sẽ thu được củ hoa Lan huệ trưởng thành. Đây là phương pháp nhân giống cho hệ số nhân giống cao. Tuy nhiên, nếu dùng củ mẹ bị nhiễm bệnh thì sự lây lan sang các vảy vẫn cịn tồn tại.
Việc lựa chọn mơ nuôi cấy rất quan trọng, nghiên cứu về việc sử dụng vảy củ để nuôi cấy, trong các năm 2008 – 2009, Nguyễn Hạnh Hoa và cộng sự cho rằng đối với hoa Lan huệ, sử dụng vảy củ đôi làm vật liệu khởi đầu rất dễ dàng và cho hiệu quả cao hơn nhiều so với sử dụng các bộ phận khác [5].
Ninh Thị Thảovà cộng sự (2009) đã bước đầu nghiên cứu quy trình nhân
nhanh in vitro cây hoa loa kèn đỏ nhung (H. equestre Herb) nhằm tìm ta các thơng số kỹ thuật thích hợp cho quy trình nhân giống in vitro lồi này. Nghiên cứu cho
những kết quả bước đầu khi xác định bộ phận vào mẫu tốt nhất là phần đếcủ mang 2 vảy củ, môi trường vào mẫu tốt nhất là mơi trường MS có bổsung 5,0 mg/l BA. Môi trường MS bổsung 1,0 mg/l BA và 0,5 mg/l α-NAA cho hệ số nhân chồi cao nhất. Trên môi trường chứa 0,2 mg/l α-NAA, 91,67% các chồi ra rễ, sốlượng rễ nhiều, chất lượng tốt [11].
Nguyễn Thị Phương Thảo và cộng sự năm 2010 đã nghiên cứu nhằm tìm ra
các thơng số thích hợp hướng tới nhân giống in vitrocây Lan huệ mạng
(Hispeastrum reticulatum var. striatifolium) [10]. Trên mơi trường nềnMS có bổ
sung 3,0 mg/l BA mẫu tái sinh chồi và củ in vitrocao. Chồi và củ in vitrotiếp tục
được sử dụng cho thí nghiệm nhân nhanh và cũng thu được kết quả rất tốt. Các
cây con in vitrosau đó được đưa ra môi trường, tỷ lệ sống sót cao, cây con sinh
trưởng khoẻ mạnh.
Qua đó ta thấy, dù có rất nhiều thuận lợi trong nghiên cứu nhân giống nhưng chưa có nhiều nghiên cứu sâu về nhân giống Lan huệ để duy trì nguồn gen chọn lọc, ưu tú phục vụ cơng tác chọn tạo giống. Đặc biệt, chưa có nghiên cứu nào nhằm xây dựng quy trình nhân giống chuẩn cho các dịng Lan huệ nhập ngoại và nội. Do đó,
việc nghiên cứu nhân giống in vitro các dòng Lan huệ để làm cơ sở xây dựng quy
Chương2–VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU