3.4.2 .Ảnh hưởng của hàm lượng đường tới chất lượng chồiin vitro
3.5. Nghiên cứu ra rễ tạo cây hoàn chỉnh
3.5.2. Ảnh hưởng của than hoạt tính tới khả năng ra rễ và chất lượng rễ
Vai trị tích cực của than hoạt tính đã được chứng minh trong nhiều nghiên cứu trên các đối tượng khác nhau. Theo đó, than hoạt tính có tác dụng hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các sản phẩm trao đổi thứ cấp… Và đặc biệt, than hoạt tính làm thay đổi mơi trường ánh sáng do làm cho mơi trường sẫm màu, nên có thể kích thích sự hình thành và sinh trưởng của rễ [13]. Vì vậy, trong thí nghiệm này sử dụng than hoạt tính với các nồng độ khác nhau bổ sung vào môi trường nền(MTN): MS + 30g/l Saccharose + 5,8g/l agar để xác định vai trò của than hoạt tính đối với sự ra rễ của cây Lan huệ. Kết quả thí nghiệm được thể hiện qua Bảng 3.12.
Từ kết quả ở Bảng 3.12 cho thấy tỷ lệ ra rễ ở các dòng Lan huệ tương đương so với công thức bổ sung IBA, tuy nhiên, chất lượng bộ rễ tăng lên đáng kể khi sử dụng than hoạt tính. Số rễ/chồi và chất lượng rễ đều lớn hơn so với công thức đối chứng. Khi tăng nồng độ than từ 0,25-1,0g/l thì số rễ trung bình/chồi tăng dần ở hầu hết các dòng Lan huệ và đạt số rễ cao nhất là 3,0 rễ/mẫu ở nồng độ 0,5g/l đối với dòng H18 và 2,8 rễ/mẫu ở dịng H9. Với nồng độ 0,75g/l là cơng thức tốt nhất đối với sự ra rễ ở các dòng H2, H4, H10 với số rễ/mẫu tương ứng lần lượt là 1,8; 2,0; 2,7 rễ/mẫu. Như vậy, việc bổ sung than hoạt tính đã có tác động tích cực lên số lượng rễ và chất lượng rễ. Nồng độ than hoạt tính tối ưu ảnh hưởng đến khả năng ra rễ và chất lượng rễ của các dòng Lan huệ là:
- Dòng H9,H18 là: 0,5 g/l than hoạt tính
- Dịng H2, H4, H10 là 0,75 g/l than hoạt tính
3.6.Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại giá thể đến tỷ lệ sống và sinh trưởng
và phát triển của cây Lan huệ sau in vitro ngồi vườn ươm
Trong ni cấy in vitro, cây con sinh trưởng dưới điều kiện rất đặc biệt: Mơi
trường có ánh sáng thấp, độ ẩm cao và dinh dưỡng được kiểm soát. Trong khi điều kiện tự nhiên có ánh sáng cao, độ ẩm cao và dinh dưỡng khó kiểm sốt. Do đó, khi chuyển cây con sang giai đoạn nuôi trồng trực tiếp ở nhà lưới hoặc trong điều kiện tự nhiên thường có tỷ lệ chết cao.Giai đoạn đưa cây ra thích nghi ngồi vườm ươm
có tính chất quyết định đến khả năng ứng dụng của kỹ thuật nhân giống vơ tính in
vitro.Cây in vitro khi chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng phải chịu nhiều
yếu tố tác động của ngoại cảnh như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm khơng khí, sâu bệnh...sẽ ảnh hưởng không nhỏ tới sự sinh trưởng và phát triển của cây. Do đó xác định điều kiện tối ưu để ra cây cấy mô là điều vô cùng quan trọng và cần thiết. Trên cơ sở đó, tiến hành ra cây với một số loại giá thể khác nhau.Các loại giá thể khác nhau có thể ảnh hưởng khác nhau đối với sinh trưởng và phát triển của cây trồng.
Giá thể không chỉ là nơi để cây trồng bám rễ đứng vững mà còn là nơi cung cấp nước và chất dinh dưỡng cần thiết cho cây. Giá thể chính là nơi tiếp xúc đầu tiên để cây trồng làm quen với môi trường tự nhiên. Điều này rất quan trọng với cây ni cấy mơ vì chúng thường có bộ rễ yếu.
Giá thể là cách gọi chung cho tất cả các hỗn hợp của các vật liệu có thể giữ nước, tạo độ thống cho sự phát triển của cây, hỗn hợp này được dùng đơn lẻ hoặc trộn lại để tận dụng ưu điểm từng loại (ví dụ như lớp trên là xơ dừa cho rễ, lớp dưới là sỏi để rút nước). Giá thể đơn giản trước đây bao gồm các loại đá sỏi, cát, rơm rạ, trấu hun, xơ dừa,… thường thấy trong làm giá đỗ thủ công, trồng nấm, hay trồng cây trong bể thủy canh,…tuy nhiên chúng không được sử dụng phổ biến cho tất cả loại cây trồng, cũng như trong các phương pháp ươm cây, gieo hạt thông thường, mà chỉ chuyên dùng cho những trường hợp cụ thề. Ngày nay, việc sử dụng giá thể có sự khác biệt khá nhiều, giá thể được dùng phổ biến hơn cho tất cả các phương pháp trồng cây.
Lan huệ là cây dễ thích nghi với điều kiện tự nhiên nên tỷ lệ cây sống khi đưa cây ra ngoài vườn ươm khá cao.Tiến hành nghiên cứu và sử dụng 2 loại giá thể khác nhau. Giá thể được sử dụng là Cát vàng và trấu hun theo các tỷ lệ khác nhau. Kết quả sau 4 tuần theo dõi và chăm sóc cây vườm ươm được thể hiện ở Bảng 3.13.
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của các loại giá thể đến tỷ lệ sống, sinh trưởng và phát triển của cây Lan huệ sau in vitro
(Sau 4 tuần)
Giá thể Tỷ lệ cây sống (%) Số rễ mới (rễ) Chiều dài rễ (cm) H2 H4 H9 H10 H18 H2 H4 H9 H10 H18 H2 H4 H9 H10 H18 100% CV 100 100 100 100 100 0,9 1,1 1,0 1,3 1,4 2,4 2,7 2,1 1,8 2,5 1CV: 1TH 100 100 100 100 100 1,6 1,8 1,4 1,7 2,0 2,8 3,0 2,5 2,2 3,2 3CV: 1TH 100 100 100 100 100 2,1 3,2 2,4 2,6 3,4 4,5 4,9 3,8 3,6 5,1 LSD 5% CV (%) 0,13 0,17 0,20 0,23 0,32 0,32 0,39 0,34 0,26 0,34 5,6 4,8 6,4 6,3 6,6 5,0 5,6 6,2 5,5 4,8
Hình 3.10. Ảnh hưởng của một số loại giá thể đến tỷ lệ sống và sinh trưởng và phát triển của cây Lan huệ sau in vitro
Tỷ lệ sống đạt 100% trên tất cả các cơng thức thí nghiệm.Cơng thức tỷ lệ 3:1
(3Cát vàng: 1Trấu hun)cây in vitro của cả 5 dòng Lan huệ đều sinh trưởng tốt nhất,
nguyên nhân do cát thống khí, dễ thốt nước tránh ngập úng cho cây, giúp bộ rễ phát triển tối đa. Công thức này cho tỷ lệ cây sống cao, số rễ mới mọc nhiều và chiều dài rễ đạt cao nhất ở cả 5dòng Lan huệ. Cụ thể là dòng H18 cho số rễ mới cao nhất (3,4 rễ mới) tiếp đến là dòng H4 (3,2 rễ mới), số rễ mới thấp nhất ởdòng H2 (2,1 rễ). Chiều dài rễ dòng H18 lớn nhất đạt 5,1 cm, tiếp đó là dịng H4 (4,9 cm), chiều dài rễ ngắn nhất ở cơng thức này là dịng H10 đạt 3,6 cm.
Ở công thức giá thể 100% cát vàng, số rễ mới ở các dòng rất thấp đạt từ 0,9 – 1,4 rễ/mẫu, chiều dài rễ kém (TB < 2,5 cm). Với giá thể 1Cát vàng : 1Trấu hun, cây phát triển kém, rễ mới có phát sinh nhưng thấp hơn so với giá thể nhiều cát vàng, và chiều dài rễ cũng ngắn hơn. Đặc biệt trong cơng thức này rễ có hiện tượng bị héo, đen và chết do trấu hun quá nhiều gây xót cho bộ rễ cịn non yếu của cây, độ thơng thống khí kém hơn, hạn chế sự hấp thu dinh dưỡng của bộ rễ.
Như vậy, cây sau in vitro của 5 dịng Lan huệ có bộ rễ phát triển và sinh
Hình 3.11. Ảnh hưởng của giá thể tới số lượng rễ mới và chiều dài rễ cây in
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
<<<<
Kết luận
Từ những kết quảnghiên cứu đã tiến hành rút ra một số kết luận sau:
1. Giai đoạn nuôi cấy khởi động:
Thời gian khử trùng thích hợp bằng HgCl20,1% cho 5 dòng Lan huệH2, H4, H9, H10, H18 là trong thời gian 9 phút .
Môi trường nền (MTN): MS + 30 g/l Saccharose + 5,8 g/l agar.
Vật liệu ni cấy của 5 dịng H2, H4, H9, H10, H18 là: Vảy củ đơi có dính đế củ và đế củ.
2. Nhân nhanh từ vảy củ đôi
Môi trường tối ưu cho nhân nhanh chồi in vitro từ vảy củ đơi là:
- Dịng H2, H4, H9:
MTN + 5,0mg/lBA + 0,75 mg/lKinetin + 0,25- 0,5 mg/l α-NAA; - Dòng H10, H18:
MTN + 3,0mg/l BA + 1,0mg/l Kinetin + 0,25 - 0,5 mg/l α-NAA; Hệ số nhân chồi đạt 4,5 – 5,4 chồi/mẫu, chiều cao chồi đạt 10,1 – 13,1 cm.
3. Nhân nhanh từ đế củ
Môi trường tối ưu tạo mô sẹo từ đế củ là:
- Dòng H9, H18: MTN +3,0 mg/l BA + 1,5mg/l α-NAA - Dòng H2, H4, H10: MTN +2,0 mg/l BA + 1,0 mg/l α-NAA Môi trường tối ưu phát sinh chồi từ mơ sẹo của các dịng Lan huệ là: - Dòng H10: MTN + 1,0 mg/l Kinetin + 4,0 mg/l BA;
- Dòng H18:MTN + 1,0 mg/l Kinetin + 5,0 mg/l BA;
Hệ số nhân chồi dòng H10 đạt 5,7 chồi/mẫu và 6,5 chồi/mẫu với dòng H18.
4. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh
Bổ sung60ml/l nước dừa hoặc 60-80g/l Saccharose vào mơi trườngcó hiệu
Với 4/5dòng Lan huệ, khi bổ sung IBA 1,5 mg/l vào môi trường cho tỉ lệ mẫu ra rễ đạt cao nhất (100%), các rễ đều to, mập và có màu trắng, riêng dịng H9 nồng độIBA cần bổ sung ít hơn (0,5mg/l).
Việc bổ sung than hoạt tính vào mơi trườngvới nồng độ 0,5 – 0,75 g/l có tác
dụng tốt cho sự ra rễ và chất lượng rễ của chồi in vitro.
5. Giai đoạn vườm ươm
Loại giá thể có thành phần cát vàng: trấu hun là 3:1cho tỷ lệ sống đạt 100%, bộ rễ nhiều và khỏe ở cả 5dòng Lan huệ H2, H4, H9, H10, H18.
Đề nghị
1. Cần nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng tới phản ứng tạo mô sẹo từ đế củ
đểtạo mô sẹo cho hệ số tái sinh chồi cao hơn trên các dòng Lan huệ.
2. Tiếp tục nghiên cứu cải tiến môi trường nhân nhanh nhằm nâng cao hệ số
nhân, nhất là việc sử dụng các chất có nguồn gốc tự nhiên nhằm nhân nhanh các dịng Lan huệ có triển vọng phát triển thành giống.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt
1. Nguyễn Thị Lý Anh, Đinh Thị Phịng (2007), Cơng nghệ nuôi cấy mô, NXB
Nông nghiệp, Hà Nội.
2. Nguyễn Tiến Bân (1997), Cẩm nang tra cứu và nhận biết các họ thực vật hạt
kín ở Việt Nam, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội.
3. Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng, NXB Khoa học và Kĩ thuật,
Hà Nội.
4. Nguyễn Thị Đỏ (2007), Bộ Hoa Loa Kèn – Liliales Perleb,Thực vật chí Việt
Nam (Flora of Viet Nam), NXB Khoa học và Kĩ thuật, Hà Nội.
5. Nguyễn Hạnh Hoa và cộng sự (2009), Thu thập, phân loại, đánh giá nguồn gen
hoa cây cảnh họ Hành (Liliaceae). Bước đầu tạo vật liệu khởi đầu cho chọn và nhân giống một số lồi bằng kĩ thuật ni cấy mơ và gây đột biến, Báo cáo tổng
kết đề tài cấp Bộ mã số B2008 - 11- 80.
6. Nguyễn Như Khanh (2002), Sinh học phát triển thực vật, NXB Giáo Dục Hà
Nội.
7. Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2002), Công nghệ tế bào, NXB Đại
học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh.
8. Nguyễn Quang Thạch (chủ biên), Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương
Thảo (2004), Giáo trình cơng nghệ sinh học Nơng nghiệp, NXB Nơng nghiệp,
Hà Nội.
9. Nguyễn Thị Phương Thảo (1998), Nghiên cứu nhân giống in vitro cây hoa Loa
Kèn, Luận văn Thạc sĩ Nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội.
10. Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Hạnh Hoa và Ninh Thị Thảo (2010),
“Nghiên cứu quy trình nhân nhanh in vitro cây Lan huệ mạng”, Tạp chí Khoa
học và Phát triển, Tập 8, số 3: 426 – 432, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội.
11. Ninh Thị Thảo, Nguyễn Thị Cúc, Nguyễn Hạnh Hoa và Nguyễn Thị Phương
kèn đỏ nhung (Hippeastrum equestre Herb.)”, Tạp chí Khoa học và Phát triển,
Tập 7, số 4, tr.453- 459,Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội.
12. Nguyễn Thị Quỳnh (2005), Nghiên cứuảnh hưởng của các yếu tố môi trường
lên sự tăng trưởng của một số cây thân gỗ nhiệt đới và cận nhiệt đới trong điều kiện nuôi cấy in vitro, Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN, tr. 42-44.
13. Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn (2007), Sinh lý học thực vật,
NXB Giáo dục Hà Nội.
Tài liệu Tiếng Anh
14. Bapat V.A., Narayanaswamy S. (1976), “Growth and Organogenesis in
Explanted Tissues of Amaryllis in Culture”, Bulletin of the Torrey Botany Club,
103 (2), pp. 53-56.
15. Behzad Kaviani,Sara Zakizadeh (2012), “Efect of photoperiod, auxin and
cytokinin on the multiplication rate and growth of Amaryllis (Hippeastrum
johnsonii) bulbs in vitro”, Propagation of Ornamental Plants, 13(2), pp. 78-85.
16. Bhojwani S.S., Razdan M.K. (1996), Plant tissue culture: Theory and practice, a
revised edition. Elsevier Science B.V. The Netherlands, p.113.
17. Chieh Li Huang, Kuo Cheng Chang, Hiroshi Okubo (2005), “In
vitromorphogenesis from ovaries of Hippeastrum x Hybridum”, J. Fac. Agr. Kyushu Univ., 50 (1), pp. 19 – 25.
18. De Bruyn M.M, Ferreira D.I., Slabbert M.M., Pretorius J. (1992), “In
vitropropagation of Amaryllis belladonna”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 31, pp.179-184.
19. Debergh P.C. and Zimmerman R.H. (1991), “Micropropagation technology and
application”, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, the Netherlnds,pp.1-13.
20. Epharath J.E., Ben-Asher., Baruchin F., Alekperov C., Dayan E., Silerbush M.
(2001), “Various cutting methods for the propagation of Hippeastrum bulbs”,
Biotronics, 30, pp. 75-83.
Vol.XV: The Alkaloids, pp. 83- 164.
22. George E.F. (1993), Plan propagation by Tissue Culture: Part 1, The
Technology, 2nd Edn.Exegetics, Edington, UK., pp. 337 – 356.
23. Hussey G. (1975), “Totipotency in tissue explants and callus of some members
of the Liliaceae, Iridaceae and Amaryllidaceae”, J. Exp. Rot, 26, pp. 253-262.
24. Hussey G. (1976),In-vitro Release of Axillary Shoots from Apical Dominance
in Monocotyledonous Plants. Annals of Botany, 40, pp. 1323-1325.
25. Mii M., Mori T., Iwase N. (1974), “Organ formation from the excised bulb
scales of Hippeastrum hybridum in-vitro”. J. Hortic. Sci, 49, pp. 241-244.
26. Miller C.O. (1961), “Kinetin and related compounds in plant growth”,Ann. Rev.
Plant Physiol, 12, p.395.
27. Murashige T.(1974), “Plant propagation through tissue cultures”, Annu. Rev.
Plant Physiol., Volume 25, pp. 135-166.
28. Murashige T., Skoog F. (1962), “A revised medium for rapid growth and
bioassays with tobacco tissue cultures”, Plant Physiol., 15, pp. 473-497.
29. Narayanaswamy S. (1994), Plant Cell and Tissue Culture, TATA McGraw-Hill
Pub., New dehli, India, pp.22-49.
30. Nhut D. T., Le B. V., Fukai S., Tanaka M., Van T. T. (2001), “Effects of
activated charcoal, explant size, explant position and sucrose concentration on
plant and shoot regeneration of Lilium longiflorum via young stem culture”,
Plant Growth Reg, 33, pp. 59-65.
31. Nissen, S.J., Sutter, E. G. (1990), “Stability of IAA and IBA in nutrient medium
to several tissue culture procedures”, Horticultural Science, 25, pp. 800-802.
32. O'Rourke E.N., Fountain W.M., Sharghi S. (1991), “Rapid propagation of
Hippeastrum bulblets by in vitroculture”,Herbertia, 47(1), pp. 54-55.
33. Pan M. J., Van Staden J. (1999), “Effect of activated charcoal, autoclaving and
culture media on sucrose hydrolysis”, Plant Growth Regulation, 29, pp. 135-
34. Sara Zakizadeh, Behzad Kaviani, Rasoul Onsinejad (2013), “In vitro rooting of
Amaryllis (Hippeastrumjohnsonii), a bulbous plant, via NAA and 2-iP”, Annals
of Biological Research, 4 (2), pp. 69-71.
35. Seabrook J.E.A., Cumming B.G. (1977), “The in-vitro propagation of Amaryllis
(Hippeastrum spp. hybrids)”, In vitro, Volume 13, No.12.
36. Seabrook J.E.A., Cumming B.G., Dionne L.A. (1976),“The in-vitro induction
of adventitious shoot and root apices on Narcissus (daffodil and narcissus) cultivar tissue”,Can. J. Bot, 54, pp. 814 - 819.
37. Siddique M.N.A, Sultana J., Sultana N., Hossain M.M. (2007), “Ex vitro
Establishment of in vitro Produced Plantlets and Bulblets of Hippeastrum (Hippeastrum hybridum)”,Int. J. Sustain. Crop Prod, 2(3): 22-24.
38. Slabbert M.M., De Bruyn M.M., Ferreira D.I.,Pretoricus J. (1993),
“Regeneration of bulblets from twin scales of Crinum macowaniiin vitro”.Plant
cell, Tissue and organ culture, 33 (2), pp. 133-141.
39. Sultana J., Sultana N., SiddiqueM. N. A, IslamA. K. M. A., Hossain M. M., T.
Hossain (2010), “In vitro Bulb production in Hippeastrum (Hipp. hybridum)”,
Journal of Central European Agriculture, Volume 11, No.4, pp. 469-474.
40. Tadashi Yanagawa, Takeshi Osaki (1995), “In vitropropagation of bulblets and
elimination of Viruses by Bulb-scale Cultures of Hippeastrumhybridum Bulbs”,Plant Tissue Culture Letters, 13(2), pp. 147-152.
41. Trigiano G.N., GrayD.J. (2000), Plant tissue culture concepst and laboatry
exercise, CRC Press. Florida, America.
42. Van WinkleS.C., Pullman G. S. (2001), “The combined impact of pH and
Activated Carbon on the elemental composition of plant tissue culture media”,
IPST Technical Paper, Series Number 992.
Tài liệu từ internet
43. http://www.caythuocquy.info.vn/old/modules.php?name=News&opcase=details
44. http://www.botanyvn.com/cnt.asp?param=edir&v=Hippeastrum%20piniceum&
PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 1: MƠI TRƯỜNG SỬ DỤNG TRONG THÍ NGHIỆM
Môi trường cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962)
Thành phần
Lượng lấy
1l dung dịch mẹ 1l môi trường sử dụng 1. Đa lượng (g) 50ml/l NH4NO3 33,00 KNO3 38,00 MgSO4.7H2O 10,00 KH2PO4 3,40
CaCl2 (Pha riêng) 6,60
2. Vi lượng (mg) 10ml/l H3BO3 620,000 MnSO4.4H2O 2230,00 ZnSO4.4H2O 860,00 KI 83,00 MoNa2.2H2O 25,00 CoCl2.6H2O 2,50 CuSO4.5H2O 2,50 3. Sắt (g)