3.2.1 .Ảnh hưởng của BA tới sự phát sinh chồi của mẫu nuôi cấy
3.3.2 Ảnh hưởng củaα-NAA tới sự phát sinh hình thái từ đếcủ
Axit α-naphtylaxetic(α-NAA) được tổng hợp chủ yếu ở đỉnh ngọn chồi và từ đó được vận chuyển xuống dưới (hướng gốc), là một auxin có tác dụng tốt đến các quá trình sinh trưởng của tế bào, hoạt động của tầng phân sinh, hiện tượng ưu thế ngọn, tính hướng của thực vật, sự sinh trưởng của quả và tạo ra quả khơng hạt, và có tác dụng đặc biệt trong sự hình thành rễ.
Tuy nhiên nếu kích thích với hàm lượng auxin quá cao, tác dụng quá mạnh sẽ xảy ra hiện tượng ức chế ngược trở lại, lúc này auxin sẽ trở thành chất ức chế. Tiến hành bổ sung α-NAA nồng độ từ 0 – 2,0 mg/l để nghiên cứu khả năng phát sinh hình thái của đế củ 5 dòng Lan huệ. Kết quả thu được thể hiện ở Bảng 3.6.
Kết quả Bảng 3.6 cho thấy, ở nồng độ 2,0 mg/l α-NAA cho tỷ lệ mẫu đế củ tạo rễ cao ở cả 5 dịng Lan huệ từ 65,3% - 70,7%. Với mục đích nhân giống và tăng
theo hướng tạo mô sẹo rất được quan tâm. Mô sẹo sẽ là nguồn vật liệu ni cấy cho các thí nghiệm tái sinh tạo chồi tiếp theo.
Bảng 3.5.Ảnh hưởng của 2,4-D tới khả năng phát sinh hình thái từ đế củ (sau 4 tuần)
2,4- D(mg/l)
Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) Tỷ lệ mẫu tạo sẹo (%) Đặc điểm mô sẹo
H2 H4 H9 H10 H18 H2 H4 H9 H10 H18 H2 H4 H9 H10 H18 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 - - - - - 0,25 28,5 39,5 31,3 35,8 30,1 4,1 6,2 7,6 5,7 7,8 + + + + + 0,5 32,7 49,9 39,2 41,4 35,7 9,3 11,5 8,9 10,2 15,3 + + + + + 0,75 42,1 59,2 50,8 53,5 47,4 27,4 43,2 33,3 38,4 39,4 + ++ + ++ + 1,0 58,8 65,7 64,3 68,3 61,2 33,6 23,7 46,1 28,5 48,8 ++ + ++ + ++ LSD 5% 2,76 4,13 3,92 3,94 3,74 1,56 1,62 1,77 1,56 2,49 CV (%) 4,7 5,3 5,8 5,4 5,9 5,8 5,3 5,1 5,2 6,2
Bảng 3.6.Ảnh hưởng của α-NAA tới khả năng phát sinh hình thái từ đế củ (sau 4 tuần)
α-NAA
(mg/l)
Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) Tỷ lệ mẫu tạo sẹo (%) Đặc điểm mô sẹo
H2 H4 H9 H10 H18 H2 H4 H9 H10 H18 H2 H4 H9 H10 H18 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 - - - - - 0,5 38,5 49,4 41,3 45,6 40,1 5,6 3,2 7,1 6,5 3,7 + + + + + 1,0 49,3 57,9 52,2 59,4 55,7 6,3 56,2 11,2 15,5 11,6 + ++ + + + 1,5 58,1 62,2 60,8 64,5 57,7 43,8 34,1 49,5 45,5 50,2 ++ + ++ ++ ++ 2,0 66,8 70,7 69,3 71,2 65,3 30,5 20,4 18,8 28,6 33,2 + + + + + LSD 5% 3,96 4,66 4,65 4,78 4,85 1,81 2,53 1,61 1,74 2,13 CV (%) 5,1 5,3 5,7 5,5 6,1 5,8 6,1 5,1 5,0 5,9
Theo Bảng 3.6, tỷ lệ mẫu tạo sẹo cao nhất ở dòng H4 với nồng độ α-NAA là 1,0 mg/l tương ứng là 56,2%. Mô sẹo thu được xốp, màu xanh trắng. Với nồng độ 1,5 mg/l α-NAAcác dịng H2, H9, H10, H18 có tỷ lệ mẫu tạo sẹo cao, tương ứng là 43,8%, 49,5%, 45,5% và 50,2%. Trong đó mơ sẹo của dịng H10, H18 có hình thái tốt, chắc, màu vàng xanh thể hiện trong hình 3.4. So sánh kết quả Bảng 3.5 và Bảng 3.6 cho thấy, với vật liệu nuôi cấy là đế củ của 5 dịng Lan huệ trên mơi trường bổ sungα-NAA cho tỷ lệ mẫu tạo mơ sẹo cao hơn và hình thái mơ sẹo tốt hơn so với trên môi trường bổ sung 2,4-D. Như vậy, nồng độ α-NAA thích hợp cho sự phát sinh tạo mơ sẹo ở các dịng Lan huệ là:
- Dòng H2, H9, H10, H18 là: 1,5 mg/lα-NAA
- Dòng H4 là: 1,0 mg/lα-NAA
3.3.3. Ảnh hưởng của BA và α-NAAđến khả năng phát sinh hình thái từ đế củ
Sự phối hợp của nhóm auxin và cytokinin ở nồng độ khác nhau cho sự phát sinh hình thái của mẫu ni cấy theo các đường hướng khác nhau. Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của BA và α-NAA đến khả năng phát sinh hình thái từ đế củ. Nồng độα-NAA tối ưu được sử dụng từ nghiên cứu ở mục 3.3.2 phối hợp sử dụng nồng độ BA từ 1,0 mg/l – 4,0 mg/l, với dòng H4 nồng độ α-NAA tối ưu là 1,0 mg/l, 4 dòng còn lại nồng độ α-NAAtối ưu là 1,5 mg/l α-NAA. Kết quả thu được sau 4 tuần nuôi cấy được thể hiện ở Bảng 3.7.
Kết quả Bảng 3.7 cho thấy,tỷ lệ mẫu tạo rễ ở các dòng là rất thấp, trên môi trường bổ sung từ nồng độ 2,0 mg/l – 4,0 mg/l BAđế củ của các 5 dòng Lan huệ khơng phát sinh hình thái theo hướng tạo rễ. Các mẫu nuôi cấy chủ yếu phát sinh theo hướng tạo mô sẹo. Tỷ lệ mẫu tạo sẹo ở nồng độ α-NAA phối hợp với BA ở các dòng Lan huệ là khác nhau. Cụ thể, dịng H2, H4, H10 tỷ lệ tạo mơ sẹo cao nhất ở nồng độ 2,0 mg/l BA tương ứng là 75,5%, 83,2% và 68,4%. Trong khi đó, ở nồng độ 3,0 mg/l BA phối hợp với 1,5 mg/l α-NAA cho tỷ lệ tạo mơ sẹo cao nhất ở dịng H9, H18 tương ứng là 77,1% và 79,8%. Mơ sẹo thu đượcở các dịng khác nhau, có đặc điểm khác nhau, từ chắc đến xốp, màu xanh hoặc màu xanh trắng. Trong đó, mơ sẹo thu được sau 4 tuần ni cấy có nhiều đặc điểm tốt có màu xanh và chắc là của 2 dịng H10 và H18.
Như vậy, phối hợp BA và α-NAAcho tỷ lệđế củtạo mô sẹo cao hơn khi sử dụng auxin riêng rẽ và hình thái mơ sẹo thu được tốt hơn, nhiều mô sẹo xanh và chắc. Môi trường tối ưu tạo mô sẹo từ đế củ là:
- Dòng H2, H4, H10: 2,0 mg/l BA + 1,0 mg/l α-NAA
Hình 3.5. Ảnh hưởng của BA và α-NAA đến khả năng tạo mô sẹo từ đế củ
(sau 4 tuần)
Hình 3.6. So sánh ảnh hưởng của BA và α-NAA đến khả năng tạo mô sẹo từ đế
củ (sau 4 tuần ) 0 20 40 60 80 100 CT1 CT2 CT3 CT4 Tỷ lệ t ạo m ô s ẹ o ( % )
Ảnh hưởng của BA và α-NAA đến khả năng tạo mô sẹo
từ đế củ
Bảng 3.7.Ảnh hưởng của BA và α-NAA đến khả năng phát sinh hình thái in vitro từ đế củ (Sau 4 tuần)
BA
(mg/l)
Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) Tỷ lệ mẫu tạo sẹo (%) Đặc điểm mô sẹo
H2 H4 H9 H10 H18 H2 H4 H9 H10 H18 H2 H4 H9 H10 H18
1,0 3,2 4,6 21,9 7,1 33,1 49,6 30,1 28,4 32,2 19,6 + + + + +
2,0 0 0 0 0 0 75,5 83,3 66,2 68,4 50,6 ++ ++ + +++ +
3,0 0 0 0 0 0 66,7 67,5 77,1 50,9 79,8 + + ++ ++ +++
4,0 0 0 0 0 0 43,4 38,2 41,8 30,7 38,4 + + + + +
Ghi chú: +++: Tốt (mô sẹo chắc, màu xanh vàng)++: Trung bình (mơ sẹo xốp, màu xanh trắng)+: Kém (mô sẹo xốp, màu nâu đỏ)
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của BA, Kinetin đến khả năng phát sinh chồi của mô sẹo từ đế củ(Sau 4 tuần)
BA(mg/l) Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Số chồi/mẫu (chồi) Đặc điểm chồi
H2 H4 H9 H10 H18 H2 H4 H9 H10 H18 H2 H4 H9 H10 H18 1,0 0 0 0 23,1 11,2 - - - 2,6 2,0 - - - + ++ 2,0 0 0 0 30,8 22,7 - - - 4,2 3,8 - - - + ++ 3,0 10,2 5,6 0 76,4 66,6 0,8 0,6 - 3,8 4,2 + + - ++ + 4,0 9,8 6,4 8,8 100 99,2 1,1 1,0 1,2 5,7 4,4 + + + +++ ++ 5,0 12,1 11,2 9,0 98,9 100 1,3 0,8 0.8 3,2 6,5 + + ++ ++ +++ LSD 5% 0,058 0,063 0,050 0,45 0,39 CV (%) 5,0 7,2 6,9 6,4 5,2
3.3.4.Ảnh hưởng của BA, Kinetin đến khả năng phát sinh chồi in vitro của mơ sẹo hình thành từ đế củ
Theo các kết quả nghiên cứu trong nuôi cấy mô tế bào, BA và Kinetin đều có tác dụng quyết định hình thành chồi, có khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo nhưng được sử dụng ở nồng độ và tỷ lệ khác nhau phụ thuộc vào đặc điểm từng loài, từng giai đoạn khác nhau. Trong đó, BA là một cytokinin có vai trị đặc biệt với sự phát sinh hình thái theo hướng tạo chồi mạnh.Kinetin kích thích sự phân chia tế bào mạnh mẽ, cho chất lượng chồi đẹp. Việc bổ sung Kinetin sẽ hoạt hóa q trình tổng hợp axit nucleic và protein, ảnh hưởng rõ rệt lên sự hình thành và phân hóa cơ quan của thực vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi.Trong nghiên cứu này tiến hành sử dụng phối hợp BA, Kinetin nhằm tái sinh chồi từ mô sẹo thu được trong các thí nghiệm phát sinh hình thái ở trên từ nguồn vật liệu ni cấy là đế củ. Các mơ sẹo hình thái tốt nhất của các dòng Lan huệ được lựa chọn. Nồng độ 1,0 mg/l Kinetin được sử dụng phối hợp với 1,0 mg/l – 5,0 mg/l BA. Kết quả thê hiện ở Bảng 3.8.
Kết quả Bảng 3.8, cho thấy mơ sẹo của 2 dịng H10 và H18 có khả năng bật chồi mạnh ở nồng độ từ 3,0 mg/l – 5,0 mg/l BA. Đặc biệt, tỷ lệ mơ sẹo phát sinh chồi đạt 100% với dịng H10 ở nồng độ 1 mg/l Kinetin phối hợp với 4,0 mg/l BA và đạt 100% tái sinh chồi với dòng H18 ở 5,0 mg/l BA. Tại nồng độ này,2 dòng Lan huệ cho số chồi/mẫu cao nhất, cụ thể 5,7 chồi/mẫu với dòng H10 và 6,5 chồi/mẫu với dòng Lan huệ H18. Mơ sẹo của các dịng Lan huệ cịn lại có tỷ lệ mẫu phát sinh chồi rất thấp, ở nồng độ 1,0- 2,0 mg/l BA, mơ sẹo dịng H2, H4, H9 bật chồi. Ở nồng độ 5,0 mg/l BA, tỷ lệ tạo chồi của mơ sẹo các dịng này chỉ đạt 9,0 %-12,1%, số chồi/ mẫu cũng rất thấp.Ngun nhân có thể do mơ sẹo của các dịng cịn lại xốp, khơng chắc và xanh như 2 dịng Lan huệ H10, H18 nên khả năng tái sinh chồi kém hơn mô sẹo của 2 dịng này.Như vậy, mơ sẹo từ vật liệu đế củ có khả năng tái sinh chồi tối ưu khi bổ sung:
- Dòng H10: 1,0 mg/l Kinetin + 4,0 mg/l BA
Hình 3.7.Ảnh hưởng của BA, Kinetin đến khả năng phát sinh chồi từ mô sẹo của dòng Lan huệ H10 và H18 (sau 4 tuần)
3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường tới chất lượng chồi in
vitro của 5 dòng Lan huệ
3.4.1. Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa tới chất lượng chồi in vitro
Nước dừa là một hợp chất tự nhiên được dùng nhiều trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Thành phần nước dừa có chứa nhiều các amino acid tự do, amino acid dạng liên kết có trong protein và peptid, acid hữu cơ, Saccharose, ARN, ADN. Ngồi ra, nước dừa cịn chứa các hợp chất quan trọng với các tế bào nuôi cấy phân lập như: myoinositol, các hợp chất có hoạt tính auxin và cytokinin dạng glycoside. Nhiều nghiên cứu cho thấy khi bổ sung hàm lượng nước dừa nhất định vào mơi trường ni cấy sẽ có tác dụng tốt đến sinh trưởng và phát triển của chồi. Khi tiến hành các thí nghiệm nhân nhanh nhận thấy hệ số nhân chồi đã được cải thiện đáng kể nhưng chất lượng chồi chưa thật đẹp, khỏe. Do đó, nhằm nâng cao hơn nữa hệ số nhân chồi, tăng khả năng sinh trưởng và phát triển chồi trên mơi trường tạo cây hồn chỉnh, tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa lên sự sinh trưởng và phát triển của chồi. Thí nghiệm được tiến hành trên mơi trường nền MS +
30g/l Saccharose + 5,8g/l agar, pH = 5 trường. Kết quả thí nghiệ
Theo kết quả Bảng
sinh trưởng của chồi in vitro
đáng kể. Chồi xanh,đẹp, kh lá/chồi tăng lên khoảng dòng H4 là 4,4 cm, thấp nh tăng lần lượt từ 2,2 – 4,0 lá/ch giống Lan huệ.Như vậy, khi b
của chồi in vitro.
Hình 3.8. Ảnh hưởng c
g/l agar, pH = 5,7, bổ sung nước dừa từ 30 ệm sau 4 tuần nghiên cứu được thể hiện qua B ng 3.9 ta thấy, 60ml/l nước dừa là công thức t
vitro của cả 5 dòng Lan huệ. Chất lượng chồi đư
p, khỏe hơn. Ở nồng độ này chiều cao chồ 3 lần so với đối chứng. Cụ thể chồi dòng H2 p nhất là chồi dòng H18 cũng đạt 3,9 cm. S
4,0 lá/chồi.Đây là nguồn cây in vitro rất tốt cho quy trình nhân
y, khi bổ sung 60 ml/l nước dừa là tối ưu cho s
ng củanước dừa tới chất lượng chồi in vitro(sau 4
30 – 120 ml/l môi Bảng 3.9. c tối ưu cho sự
i được cải thiện ồi, cũng như số dòng H2 đạt 5,4 cm, cm. Số lá/chồi cũng t cho quy trình nhân i ưu cho sự sinh trưởng
Bảng 3.9.Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa tới chất lượng chồi in vitro(sau 4 tuần)
Nước dừa (ml/l)
Chiều cao chồi (cm) Số lá (Lá/chồi)
H2 H4 H9 H10 H18 H2 H4 H9 H10 H18 0 1,9 1,5 1,7 1,3 1,4 1,7 2,3 1,8 1,5 1,3 30 3,4 3,1 3,5 3,3 3,0 1,8 3,4 2,1 2,0 1,9 60 5,4 4,4 4,2 4,2 3,9 2,2 2,6 3,8 3,6 4,0 90 4,5 3,4 3,3 3,2 3,7 2,0 2,4 3,4 3,0 3,6 120 3,8 2,7 3,0 3,5 2,8 1,9 3,6 2,4 2,7 2,1 LSD 5% 0,38 0,28 0,26 0,31 0,32 0,21 0,26 0,31 0,25 0,23 CV (%) 5,8 5,5 5,0 5,9 6,4 6,0 5,0 6,3 5,4 4,8
Bảng 3.10.Ảnh hưởng của hàm lượng đường tới chất lượng chồi in vitro(sau 4 tuần)
Saccharose (g/l)
Chiều cao chồi (cm) Số lá (Lá/chồi)
H2 H4 H9 H10 H18 H2 H4 H9 H10 H18 0 1,8 1,2 1,7 1,9 1,4 1,6 1,2 1,3 1,2 1,4 20 3,6 1,5 2,0 2,4 2,0 2,1 1,6 1,8 1,6 1,7 40 3,4 1,7 2,9 3,2 2,7 2,4 2,0 2,1 1,9 1,9 60 4,1 2,2 4,0 3,9 3,2 1,8 2,3 2,7 2,5 2,1 80 5,5 3,8 3,3 3,2 4,2 2,4 2,6 2,4 2,1 2,7 LSD 5% 0,34 0,18 0,29 0,32 0,27 0,21 0,21 0,20 0,21 0,18 CV (%) 5,1 4,8 5,6 6,0 5,5 5,8 6,0 5,4 6,4 5,1
3.4.2.Ảnh hưởng của hàm lượng đường tới chất lượng chồi in vitro
Saccharose với các nồng độ khác nhau được đánh giá là có ảnh hưởng rõ rệt tới chất lượng chồi, số lá trên chồi của nhóm cây thân hành. Các chồi hoa Lan huệ sau khi đã tạo ra sẽ được tách và cấy vào môi trường MTN: MS + 5,8g/l agar +Saccharose với các nồng độ khác nhau. Kết quả thí nghiệm được trình bày qua Bảng 3.10.
Kết quả từ Bảng 3.10 cho thấy nồng độ đường có ảnh hưởng rõ rệt tới chất
lượng chồi in vitrocây hoa Lan huệ so với đối chứng. Nồng độ đường chất lượng
chồi đẹp nhất ở hầu hết các dòng Lan huệ là bổ sung từ 60-80g/l. Cụ thể, ở nồng độ
60g/l Saccharose, chồi in vitrodòng Lan huệ H9, H10 cho đạt chiều cao chồi tốt
nhất lần lượt là 4,0 và 3,9 cm. Ở nồng độ 80 g/l đường, các dòng còn lại đạt chiều cao tốt nhất. Điển hình là dịng H2 đạt 5,5 cm, tiếp đó là H18 (4,2 cm), H4 (3,8cm). Bên cạnh đó, số lá/chồi cũng được cải thiện tăng đáng kể ở 2 công thức này so với ĐC từ 2,4 – 2,7 lá/chồi.
Như vậy, để tăng chất lượng chồi in vitro của 5 dòng Lan huệ có thể sử dụng:
- Dịng H9, H10: 60 mg/l Saccharose
- Dòng H2, H4, H18: 80 mg/l Saccharose
3.5. Nghiên cứu ra rễ tạo cây hoàn chỉnh
Bộ rễ là cơ quan quan trọng nhất đối với cây trồng. Trong nuôi cấy mô, cây
in vitrosau khi kết thúc giai đoạn sống dị dưỡng chuyển sang giai đoạn sống tự
dưỡng trong tự nhiên cần phải có bộ rễ khỏe, hồn chỉnh giúp cây có khả năng hút nước và dinh dưỡng tốt, làm tiền đề cho sự sinh trưởng và phát triển sau này.Do đó cần nghiên cứu để tìm ra mơi trường ra rễ thích hợp cho cây.Vì vậy giai đoạn kích thích sự ra rễ của các chồi là giai đoạn quan trọng và không thể thiếu. Khi kết thúc giai đoạn nhân nhanh đã tạo ra được số lượng chồi đồng nhất và khỏe mạnh. Các chồi này được đưa vào mơi trường kích thích ra rễ. Trong môi trường này bộ rễ phát triển hoàn hảo hơn, đảm bảo tỷ lệ sống và khả năng sinh trưởng cao khi đưa ra ngoài vườn ươm.Khi các chồi đạt tiêu chuẩn cho ra rễ, có chiều cao 3 - 5 cm, chồi mập khỏe, lá to, xanh thì được chuyển sang các môi trường ra rễ tạo cây
hoàn chỉnh.
3.5.1. Ảnh hưởng của IBA tới khả năng ra rễ và chất lượng rễ
Các thí nghiệm được tiến hành trên môi trường nền (MTN): MS + 30g/l Saccharose+ 5,8g/l agar.
IBA là một auxin có tác dụng tốt đến các quá trình sinh trưởng của tế bào và có tác dụng đặc biệt trong sự hình thành rễ. Nhưng nếu kích thích với hàm lượng quá cao,tác dụng quá mạnh cũng như một số auxin khácsẽ xảy ra hiện tượng ức chế ngược trở lại, lúc này auxin sẽ trở thành chất ức chế. Môi trường ra rễ thường được bổ sung các auxin để kích thích và nâng cao khả năng ra rễ cũng như chất lượng rễ.