Số liệu được xử lý theo chương trình MICROSOFT EXCEL và IRISTART 5.0 trên máy vi tính.
Các cơng thức so sánh được tiến hành theo phương pháp kiểm tra sự sai khác giữa các giá trị trung bình bằng phép ước lượng và sử dụng tiêu chuẩn LSD (độ tin cậy là 95%).
Kiểm tra độ biến động của thí nghiệm được biểu hiện qua chỉ số tiêu chuẩn CV%.
Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫutạo nguồn vật liệu nuôi cấy cho
nhân giốngin vitrocác dòng Lan huệ
Tạo mẫu sạch in vitro và chọn vật liệu khởi đầu là điều kiện tiên quyết để quyết định thành cơng của quy trình nhân giống in vitrobất kỳ một đối tượng nào.
Bởi vì đây chính là giai đoạn cung cấp nguồn mẫu sạch, cho hệ số nhân cao cho các
giai đoạn tiếp theo của quá trình nhân giống. Để tạo được mẫu ni cấyin vitro sạch
phải trải qua rất nhiều các giai đoạn. Trong đó, việc xác định được hóa chất chất khử trùng thích hợp, thời gian khử trùng tối ưu trong một quy trình khử trùng mẫu là rất quan trọng.
Xác định thời gian khử trùng thích hợp
Khử trùng mẫu là khâu quan trọng nhằm loại bỏ các nguồn nấm, vi khuẩn khỏi mẫu, thu được nguồn mẫu cấy vô trùng cho các nghiên cứu tiếp theo. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới kết quả khử trùng như phương pháp lấy mẫu, thời điểm lấy mẫu, thời gian khử trùng, hóa chất khử trùng...
Đối với các cây thuộc họ Liliaceae, khi sử dụng phương pháp nhân giơng in-
vitro thì yếu tố ảnh hưởng quyết định đến hiệu quả nhân giống là loại vật liệu sử
dụng ban đầu.Trong nghiên cứu này, sử dụng vảy củ đôi và đế củ được cắt từ củ của 5 dịng Lan huệ để làm vật liệu ni cấy.
Với vật liệu nuôi cấy là củ của các cây có củ nói chung và cây Lan huệ nói riêng, hóa chất khử trùng thường được sử dụng là HgCl2 0,1%. Bên cạnh đó, việc sử dụng phối hợp Javen hoặc dung dịch Johnson 10% cũng làm tăng hiệu quả khử trùng. Thí nghiệm tiến hành khử trùng củ Lan huệ ở các khoảng thời gian khử trùng khác nhau với dung dịch HgCl20,1%. Sau đó khi tráng lại bằng nước cất từ 4 – 5 lần, chia củ ra làm 2 – 4 phần, tiếp tục ngâm mẫu vào dung dịch Johnson 1% trongthời gian3 phút, rửa lại bằng nước cất vô trùng 2 – 3 lần. Sau đó cắt mẫu ở kích thước nhất định và cấy vào môi trường vào mẫu cơ bản là MS + 30g/l Saccharose + 5,8g/l agar, thường là từ sau 2-3 tuần những mẫu sạch bắt đầu tái
sinh. Đánh giá khả năng tái sinh của mẫu là bước tiếp theo để tìm ra cơng thức khử trùng tốt nhất. Kết quả thu được sau 4 tuần thể hiện ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến khả năng vào mẫu của cácdòng Lan huệ (sau 4 tuần)
Thời gian khử trùng (phút) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu sạch (%) H2 H4 H9 H10 H18 H2 H4 H9 H10 H18 5 99,6 100 99,7 100 100 30,6 46,2 45,9 49,7 47,3 7 92,9 90,6 87,2 88,1 89,5 88,2 82,6 79,7 81,8 80,2 9 61,6 63,2 68,1 79,2 77,6 98,1 96,6 99,2 100 99,7 11 58,3 60,6 62,2 50,6 58,2 100 100 100 99,6 99,5 13 42,5 51,6 47,9 48,3 49,4 100 100 100 97,5 98,4
Thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1 % quyết định đến tỷ lệ mẫu sống.HgCl20,1% là chất khử trùng mạnh được sử dụng để loại bỏ nấm, vi khuẩn
trên mẫu cấy có nguồn in vivonhưng cũng đồng thời tác động trực tiếp vào mô, làm
tổn thương hoặc gây chết mô nếu thời gian khử trùng dài tùy vào cấu tạo thành tế bào của từng loại mô nuôi cấy. Tuy nhiên nếu thời gian khử trùng khơng tối ưu thì mẫu lại không sạch nấm, vi khuẩn, tỷ lệ mẫu nhiễm sẽ cao. Kết quả Bảng 3.1 cho thấy, với 5 dòng Lan huệ H2, H4, H9, H10, H18 khi khử trùng với HgCl2 0,1% trong thời gian 9 phút cho tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu sạch tối ưu nhất cho q trình ni cấy. Tỷ lệ mẫu sạch đạt từ 98,1% - 100%, tỷ lệ mẫu sống đạt 61,6% - 79,2%. Trong khi đó nếu tăng thời gian khử trùng lên 11 phút, thì tỷ lệ mẫu sạch có cao hơn từ 99,5%- 100% nhưng tỷ lệ mẫu sống lại thấp hơn nhiều, chiếm khoảng 50,6% - 62,2 %.
Như vậy, với 5 dòng Lan huệ H2, H4, H9, H10, H18 có thể khử trùng mẫu bằng HgCl2 0,1% trong thời gian tối ưu là 9 phút.
3.2. Ảnh hưởng của nhóm chất điều hịa sinh trưởng riêng rẽ và phối hợp đến sự phát sinh chồi và hệ số nhân từ vảy củ đôi sự phát sinh chồi và hệ số nhân từ vảy củ đơi
Chất điều hồ sinh trưởng không những là cơng cụ hữu ích giúp chúng ta nghiên cứu sâu hơn về sự phát sinh hình thái thực vật mà còn giúp ta chủ động định
hướng cho sự phát triển của thực vật trong ống nghiệm. Đặc biệt với mục đích nhân giống tạo số lượng lớn trong thời gian ngắn thì việc sử dụng các loại chất điều tiết sinh trưởng ở nồng độ khác nhau cho tỷ lệ mẫu tái sinh lớn nhất là tất yếu.
Vật liệu nuôi cấy là vảy củ đôi được khử trùng theo công thức khử trùng tốt nhất suy ra từ kết quả nghiên cứu phần 3.1.