2.1.1.Đối tượng
Đối tượng nghiên cứu: 05dòng Lan huệ(Hispeastrum esquestre)
Kí hiệu các dịng Lan huệ lần lượt là: H2, H4, H9, H10, H18. Các dòng Lan
huệ là kết quả của phép lai hữu tính giữa các dịng bố mẹ sau: Ký hiệu dòng Lan huệ Nguồn gốc tổ hợp lai Màu sắc H2 ♂Đỏ nhung X ♀ Đỏ sọc trắng H4 ♂Đỏ NhungX ♀ Trắng H9 ♂Đỏ sọc trắng x ♀ Đỏ Nhung
H10 ♂Đỏ Nhung X ♀ Đỏ sọc xanh
H18 ♂ Đỏ sọc trắng X ♀ Đỏ nhung
2.1.2 Vật liệu
Vật liệu sử dụng cho thí nghiệm là vảy củ đơi gồm 2 vảy có kích thước 10
mm x10 mm có dính phần đế củ; đế củ kích thước 5mm x 5mm.
Mơi trường ni cấy:
Các mơi trường có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng, than hoạt tính, với các nồng độ khác nhau tùy từng thí nghiệm.
Giá trị pH của môi trường nuôi cấy được điều chỉnh trước khi khử trùng: 5,6 Môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở 121oC, áp suất 1,1 atm trong 20 phút.
Vật liệu ngoài vườn ươm:
Giá thể sử dụng: Cát vàng, Trấu hun. Phân bón qua lá: Growmore.
2.1.3.Điều kiện nuôi cấy
- Các dụng cụ được sử dụng trong nuôi cấy:
Dao, kéo, panh được vô trùng bằng ngọn lửa đèn cồn.
Tủ cấy được vô trùng bằng đèn tử ngoại 20 – 30 phút.
Nhiệt độ phịng ni: 25oC ± 2
Cường độ ánh sáng: 2000 lux
Độ ẩm 70%
Thời gian chiếu sáng: 14h sáng/ 10h tối.
2.1.4.Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm: Thí nghiệm được tiến hành tại Viện Sinh học Nông nghiệp - Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
- Thời gian: Từ tháng 6/2013 – 11/2014 2.2.Phương phápbố trí thí nghiệm
Các thí nghiệm trong phịng được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên (RCB), mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại từ 5-10 bình (tùy từng thí nghiệm), mỗi bình cấy từ 3-4 mẫu.
Thí nghiệm ngồi vườn ươm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên (RCB), mỗi công thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại trồng 5 chậu, mỗi chậu trồng 3 cây.
2.2.1.Giai đoạn nuôi cấy khởi động
Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến khả năng vào mẫu in vitro
Vật liệu ni cấy: Củ của 5 dịng Lan huệ Chất khử trùng: HgCl2 0,1%
Môi trường nền: MS + 30g/l Saccharose + 5,8 g/l agar Thí nghiệm tiến hành trên 5 công thức:
Thời gian khử trùng 5 phút trong dung dịch HgCl2 0,1% Thời gian khử trùng 7 phút trong dung dịch HgCl2 0,1% Thời gian khử trùng 9 phút trong dung dịch HgCl2 0,1% Thời gian khử trùng 11 phút trong dung dịch HgCl2 0,1% Thời gian khử trùng 13 phút trong dung dịch HgCl2 0,1%
2.2.2.Giai đoạn nhân nhanh
2.2.2.1. Nghiên cứu khả năng phát sinh hình thái và nhân nhanh từ vảy củ đơi a. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA tới sự phát sinh hình thái của mẫu ni cấy
Vật liệu ni cấy: Vảy củ đơi có dính đế củ sạch bệnh MTN:MS + 30g/l Saccharose + 5,8 g/l agar
Thí nghiệm tiến hành trên 5 cơng thức: MTN + 0 mg/l BA (ĐC)
MTN + 1,0 mg/l BA MTN + 3,0 mg/l BA MTN + 5,0 mg/l BA MTN + 7,0 mg/l BA.
b. Nghiên cứu ảnh hưởng của sự phối hợp BA và Kinetin đến khả năng phát sinh hình thái của vảy củ đơi
Vật liệu sử dụng để tiến hành thí nghiệm là vảy củ đơi có dính đế củ.
Mơi trường nền(MTN): MS + Nồng độ BA cho hệ số nhân tốt nhất ở thí nghiệm mục 2.2.2.1. a+ 30g/l Saccharose + 5,8 g/l agar.
Thí nghiệm gồm 4 cơng thức như sau: MTN + 0,25 mg/l Kinetin
MTN + 0,5 mg/l Kinetin MTN + 0,75 mg/l Kinetin MTN + 1,0mg/l Kinetin
c. Nghiên cứu ảnh hưởng của sự phối hợp hai nhóm chất auxin/cytokinin đến khả năng phát sinh chồi in vitro từ vảy củ đôi
Vật liệu sử dụng để tiến hành thí nghiệm là vảy củ đơi có dính đế củ.
Thí nghiệm tiến hành gồm 5 cơng thức
Môi trường nền (MTN): MS + Nồng độ BA và Kinetin cho hệ số nhân tốt nhất ở thí nghiệm mục 2.2.2.1. b +30g/l Saccharose + 5,8 g/l agar.
MTN + 0 mg/l α-NAA (ĐC) MTN + 0,25 mg/ α-NAA MTN + 0,5 mg/l α-NAA MTN + 0,75 mg/l α-NAA MTN + 1,0 mg/l α-NAA
2.2.2.2.Nghiên cứu khả năng phát sinh hình thái và nhân nhanh từ đế củ a. Ảnh hưởng của 2,4-D tới khả năng phát sinh hình thái từ đế củ
Vật liệu sử dụng để tiến hành thí nghiệm là đế củ.
Môi trường nền (MTN): MS +30g/l Saccharose + 5,8 g/l agar. Thí nghiệm được tiến hành trên 6 công thức:
MTN + 0 mg/l 2,4-D (ĐC) MTN + 0,1 mg/l 2,4-D MTN + 0,3 mg/l 2,4-D MTN + 0,5 mg/l 2,4-D MTN + 0,7 mg/l 2,4-D MTN + 1,0 mg/l 2,4-D.
b.Ảnh hưởng của α-NAA tới sự phát sinh hình thái từ đế củ
Môi trường nền (MTN): MS +30g/l Saccharose + 5,8 g/l agar. Thí nghiệm tiến hành trên 5 cơng thức:
(ĐC): MTN + 0 mg/l α-NAA MTN + 1,0 mg/l α-NAA MTN + 2,0 mg/l α-NAA MTN + 3,0 mg/l α-NAA MTN + 4,0 mg/l α-NAA
c. Ảnh hưởng của BA và α-NAA tới sự phát sinh hình thái từ đế củ
Vật liệu sử dụng để tiến hành thí nghiệm là đế củ.
Mơi trường nền (MTN): MS + Nồng độα-NAA hệ số nhân tốt nhất ở TN mục 2.2.2.2. b +30g/l Saccharose + 5,8 g/l agar.
Thí nghiệm tiến hành trên 4 công thức: MTN + 1,0 mg/l BA.
MTN + 2,0 mg/l BA. MTN + 3,0 mg/l BA. MTN + 4,0 mg/l BA
d.Ảnh hưởng của BA vàKinetin đến khả năng phát sinh chồi của mô sẹo từ đế củ
Vật liệu sử dụng để tiến hành thí nghiệm là đế củ.
Môi trường nền (MTN): MS+1,0 mg/l Kinetin+30g/l Saccharose +5,8 g/l agar. Thí nghiệm tiến hành trên 5 cơng thức:
: MTN + 1,0 mg/l BA (ĐC) MTN + 2,0 mg/ BA
MTN + 3,0 mg/l BA MTN + 4,0 mg/l BA MTN + 5,0 mg/l BA
2.2.2.3.Ảnh hưởng của thành phần môi trường tới chất lượng chồi in vitro a. Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa tới chất lượng chồi in vitro
Vật liệu sử dụng để tiến hành thí nghiệm là chồi in vitro.
Thí nghiệm tiến hành trên 5 cơng thức: (ĐC): MTN + 0 ml ND MTN + 30 ml/l ND MTN + 60 ml/l ND MTN + 90 ml/l ND MTN + 120 ml/l ND
b. Ảnh hưởng của hàm lượng đường tới chất lượng chồi in vitro.
Vật liệu sử dụng để tiến hành thí nghiệm là chồi in vitro.
Thí nghiệm tiến hành trên 5 cơng thức (ĐC): MS + 0g/l Saccharose+ 5,8g/l agar. MS + 30g/l Saccharose + 5,8g/l agar MS + 60g/l Saccharose+ 5,8g/l agar MS + 90g/l Saccharose+ 5,8g/l agar. MS + 120g/l Saccharose+ 5,8g/l agar.
2.2.3.Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh
Vật liệu sử dụng để tiến hành thí nghiệm là các chồi nhỏ in vitrovới các tiêu
chuẩn sau: cao 2,5 – 4,0 cm và có từ 2 lá trở nên.
Môi trường nền (MTN): MS + 30g/l Saccharose + 5,8g/l agar.
2.2.3.1. Ảnh hưởng của IBA tới khả năng ra rễ và chất lượng rễ
Thí nghiệm tiến hành trên 5 cơng thức (ĐC): MTN + 0 mg/l IBA.
MTN + 0,5 mg/l IBA. MTN + 1,0 mg/l IBA. MTN + 1,5 mg/l IBA. MTN + 2,0 mg/l IBA.
2.2.3.2. Ảnh hưởng của than hoạt tính tới khả năng ra rễ và chất lượng rễ
MTN + 0 g/l than hoạt tính (ĐC) MTN + 0,25 g/l than hoạt tính. MTN + 0,5 g/l than hoạt tính MTN + 0,75g/l than hoạt tính MTN + 1,0 g/l than hoạt tính
2.2.4. Giai đoạn vườn ươm
Cây in vitrocho ra khỏi môi trường tạo rễ, cây cao 4 – 5 cm, mọc 2 – 3 lá và
có 3 – 4 rễ đủ tiêu chuẩn đưa ra ngoài vườn ươm.
Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại giá thể đến tỷ lệ sống và sinh trưởng và phát triển của cây Lan huệ sau in vitro ngồi vườn ươm.
Thí nghiệm có 3 cơng thức như sau: Giá thể 100% Cát vàng
Giá thể 50% Cát vàng + 50% Trấu hun Giá thể 75% Cát vàng+ 25% Trấu hun
Sử dụng phân bón qua lá Growmore phun định kỳ 7 ngày/ lần 2.3.Các chỉ tiêu theo dõi
Giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu: 4 – 6 tuần
Giai đoạn nhân nhanh:6 – 8 tuần
* Khả năng phát sinh hình thái từ vảy củ đơi và đế củ
4. Hệ số nhân chồi (chồi/mẫu) = Σ Số chồi tạo thành Σ Số mẫu nuôi cấy 5. Chiều cao TB của chồi (cm) = Σ Chiều cao các chồi theo dõi
Σ Số chồi 1. Tỷ lệ tạo mẫu sạch ( %) =
Σ Số mẫu sạch bệnh
× 100 Σ Số mẫu nuôi cấy
2. Tỷ lệ tạo mẫu sống ( %) =
Σ Số mẫu sống
× 100 Σ Số mẫu ni cấy
6. Số lá TB của chồi (lá/chồi) = Σ Số lá các chồi theo dõi Σ Số chồi ban đầu
7. Tỷ lệ hình thành callus (%) = ∑ Số mẫu tạo callus ∑ Số mẫu ban đầu
8. Tỷ lệ mẫu phát sinh chồi (%) = ∑ Số mẫu tạo chồi ∑ Số mẫu ban đầu
Giai đoạn ra rễ: 3 – 4 tuần
10. Tỷ lệ ra rễ (%) =
Σ Số chồi ra rễ
× 100 Σ Số chồi theo dõi
11. Số rễ TB/chồi (Rễ) =
Σ Số rễ của các chồi theo dõi Σ Số chồi theo dõi
12. Độ dài trung bình của rễ (cm) =
Σ Chiều dài các rễ theo dõi Σ Số rễ theo dõi
Giai đoạn đưa cây in vitrora vườn ươm: 4 – 6 tuần
13. Tỷ lệ cây sống ( %) =
Σ Số cây sống
× 100 Σ Số cây đưa ra giá thể
14. Chiều cao TB của cây (cm) =
Σ Chiều cao các cây theo dõi Σ Số cây theo dõi
15. Số lá TB của cây (lá/cây) =
Σ Số lá các cây theo dõi Σ Số cây theo dõi
2.4.Phương pháp tiến hành
2.4.1.Phương pháp khử trùng mẫu cấy
Mẫu cấy được khử trùng theo quy trình: Vật liệu ni cấy là củ (thân hành) được thu hái, được làm sạch bề mặt dưới vòi nước chảy mạnh. Sau đó, củ được
rửa sạch bằng xà phịng trong 10 phút và rửa lại dưới vòi nước sạch trong 5 phút. Trong buồng cấy vô trùng, củđược ngâm trong cồn 700 trong 30 giây, tráng lại bằng nước cất vô trùng 1 - 2 lần, mỗi lần trong 1 phút. Tiếp theo ngâm mẫu trong dung dịch HgCl2 0,1% trong thời gian tối ưu, rửa lại 4 – 5 lần bằng nước cất vô trùng, mỗi lần 1 phút. Tiếp tục ngâm mẫu vào dung dịch Johnson 1% trong 3 phút, rửa lại bằng nước cất vô trùng 2 – 3 lần. Sau đó cắt mẫu ở kích thước nhất định và cấy vào mơi trường vào mẫu cơ bản là MS + 30g/l Saccharose + 5,8g/l agar.
2.4.2.Phương pháp nhân nhanh
Các mẫu sạch bệnh, xanh tốt sau giai đoạn khử trùng sẽ được chuyển sang mơi trường có bổ sung BA và Kinetin để xác định ảnh hưởng của auxin (α-NAA, 2,4D) và cytokinin (BA, Kinetin) tới khả năng tái sinh, hệ số nhân và chất lượng chồi nuôi cấy từ vảy củ đôi, đế củ.
Vảy củ đôi sau giai đoạn khử trùng được cấy vào môi trường bổ sung các
chất điều tiết sinh trưởng để tạo chồi. Chồiin vitrođược cấy chuyển vào mơi trường
nhân nhanh có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởngnhằm tăng hệ số nhân.
Đế củ sau giai đoạn khử trùng được ni cấy khởi động vào mơi trường có
bổ sung chất điều tiết sinh trưởng (tạo chồi in vitro trực tiếp) hoặc môi trường tạo mô sẹo (gián tiếp tạo chồi in vitro). Mô sẹo tiếp tục được cấy vào môi trường tái sinh chồi có bổ sung nhóm hợp chất điều tiết sinh trưởng. Chồi in vitro (qua giai
đoạn tạo chồi trực tiếp và gián tiếp) được cấy vào môi trường nhân nhanh có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng nồng độ khác nhau nhằm tăng hệ số nhân của mẫu nuôi cấy.
2.4.3.Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh
Sau giai đoạn nhân nhanh, các chồi có chiều cao 4 – 5 cm, có trạng thái sinh trưởng và phát triển bình thường được cấy vào môi trường ra rễ để tạo cây hồn chỉnh.Mơi trường ra rễ là mơi trường nền thích hợp có bổ sung các chất thuộc nhóm auxin và than hoạt tính.
2.4.4.Phương pháp ươm cây
Các cây Lan huệ hồn chỉnh trong bình được rửa sạch agar rồi trồng trên các giá thể khác nhau, tưới đẫm ngay sau khi trồng. Sau đó tưới định kỳ 1 lần/tuần.
2.5.Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý theo chương trình MICROSOFT EXCEL và IRISTART 5.0 trên máy vi tính.
Các công thức so sánh được tiến hành theo phương pháp kiểm tra sự sai khác giữa các giá trị trung bình bằng phép ước lượng và sử dụng tiêu chuẩn LSD (độ tin cậy là 95%).
Kiểm tra độ biến động của thí nghiệm được biểu hiện qua chỉ số tiêu chuẩn CV%.
Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫutạo nguồn vật liệu nuôi cấy cho
nhân giốngin vitrocác dòng Lan huệ
Tạo mẫu sạch in vitro và chọn vật liệu khởi đầu là điều kiện tiên quyết để quyết định thành cơng của quy trình nhân giống in vitrobất kỳ một đối tượng nào.
Bởi vì đây chính là giai đoạn cung cấp nguồn mẫu sạch, cho hệ số nhân cao cho các
giai đoạn tiếp theo của quá trình nhân giống. Để tạo được mẫu ni cấyin vitro sạch
phải trải qua rất nhiều các giai đoạn. Trong đó, việc xác định được hóa chất chất khử trùng thích hợp, thời gian khử trùng tối ưu trong một quy trình khử trùng mẫu là rất quan trọng.
Xác định thời gian khử trùng thích hợp
Khử trùng mẫu là khâu quan trọng nhằm loại bỏ các nguồn nấm, vi khuẩn khỏi mẫu, thu được nguồn mẫu cấy vô trùng cho các nghiên cứu tiếp theo. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới kết quả khử trùng như phương pháp lấy mẫu, thời điểm lấy mẫu, thời gian khử trùng, hóa chất khử trùng...
Đối với các cây thuộc họ Liliaceae, khi sử dụng phương pháp nhân giơng in-
vitro thì yếu tố ảnh hưởng quyết định đến hiệu quả nhân giống là loại vật liệu sử
dụng ban đầu.Trong nghiên cứu này, sử dụng vảy củ đôi và đế củ được cắt từ củ của 5 dịng Lan huệ để làm vật liệu ni cấy.
Với vật liệu nuôi cấy là củ của các cây có củ nói chung và cây Lan huệ nói riêng, hóa chất khử trùng thường được sử dụng là HgCl2 0,1%. Bên cạnh đó, việc sử dụng phối hợp Javen hoặc dung dịch Johnson 10% cũng làm tăng hiệu quả khử trùng. Thí nghiệm tiến hành khử trùng củ Lan huệ ở các khoảng thời gian khử trùng khác nhau với dung dịch HgCl20,1%. Sau đó khi tráng lại bằng nước cất từ 4 – 5 lần, chia củ ra làm 2 – 4 phần, tiếp tục ngâm mẫu vào dung dịch Johnson 1% trongthời gian3 phút, rửa lại bằng nước cất vơ trùng 2 – 3 lần. Sau đó cắt mẫu ở kích thước nhất định và cấy vào môi trường vào mẫu cơ bản là MS + 30g/l Saccharose + 5,8g/l agar, thường là từ sau 2-3 tuần những mẫu sạch bắt đầu tái
sinh. Đánh giá khả năng tái sinh của mẫu là bước tiếp theo để tìm ra cơng thức khử trùng tốt nhất. Kết quả thu được sau 4 tuần thể hiện ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến khả năng vào mẫu của cácdòng Lan huệ (sau 4 tuần)
Thời gian khử trùng (phút) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu sạch (%) H2 H4 H9 H10 H18 H2 H4 H9 H10 H18 5 99,6 100 99,7 100 100 30,6 46,2 45,9 49,7 47,3 7 92,9 90,6 87,2 88,1 89,5 88,2 82,6 79,7 81,8 80,2 9 61,6 63,2 68,1 79,2 77,6 98,1 96,6 99,2 100 99,7 11 58,3 60,6 62,2 50,6 58,2 100 100 100 99,6 99,5 13 42,5 51,6 47,9 48,3 49,4 100 100 100 97,5 98,4
Thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1 % quyết định đến tỷ lệ mẫu sống.HgCl20,1% là chất khử trùng mạnh được sử dụng để loại bỏ nấm, vi khuẩn
trên mẫu cấy có nguồn in vivonhưng cũng đồng thời tác động trực tiếp vào mô, làm
tổn thương hoặc gây chết mô nếu thời gian khử trùng dài tùy vào cấu tạo thành tế bào của từng loại mô nuôi cấy. Tuy nhiên nếu thời gian khử trùng khơng tối ưu thì mẫu lại khơng sạch nấm, vi khuẩn, tỷ lệ mẫu nhiễm sẽ cao. Kết quả Bảng 3.1 cho thấy, với 5 dòng Lan huệ H2, H4, H9, H10, H18 khi khử trùng với HgCl2 0,1% trong thời gian 9 phút cho tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu sạch tối ưu nhất cho q trình ni cấy. Tỷ lệ mẫu sạch đạt từ 98,1% - 100%, tỷ lệ mẫu sống đạt 61,6% - 79,2%.