2.1. Nguyên liệu
Mẫu thực vật đƣợc lựa chọn gồm 5 lồi cây hoạt tính sinh họcgồm Bụp giấm, đinh lăng, hoa h e, rau đắng biển, rau má. Các mẫu đƣợc thu mua tại các chợ trên địa bàn Hà Nội và một số tỉnh miền Bắc. Các mẫu thực vật đƣợc x c định tên lồi tại bộ mơn thực vật, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên.
Các mẫu thu mua đƣợc rửa sạch làm khơ và tách chiết theo qui trình ở hình 2.1 Mẫu chuẩn quercetin (C5H10O7.2H2O): Chuẩn Dƣợc điển Việt Nam, số kiểm soát 0216322.02, đƣợc dùng cho các phép thử định t nh v định lƣợng bằng phƣơng ph p phân t ch hóa lý (độ ẩm 8,75%, h m lƣợng tính theo nguyên trạng chất khan là 90,87%).
Mẫu dƣợc liệu chuẩn H e hoa đã phơi, sấy nhẹ đến khơ của cây Hịe
Styphnolobium japonicum (L) Schott, Syn. Sophora japonica L., họ Đậu (Fabaceae),
số kiểm soát CV 0116 042.01, đƣợc dùng trong các phép thử soi bột v định t nh (độ ẩm 10,0%, h m lƣợng rutin 21,1%).
2.2. Hóa chất
Dung m i methanol, acetonitril, ax t axetic băng đƣợc mua từ Merck, Đức dùng cho phân tích HPLC. Dung mơi dùng cho chiết xuất, đạt yêu cầu dung môi phân t ch đƣợc mua từ công ty TNHH TEKCO Việt Nam. Các hố chất, dung mơi cần thiết cho việc tách, chiết mẫu đều đạt độ tinh khiết cho phân tích gồm n- hexan, etyl axetat, methanol, ethanol, acetone,...
Mẫu chất chuẩn quercetin v dƣợc liệu chuẩn H e hoa đƣợc Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ƣơng/Bộ Y tế cung cấp theo các số kiểm so t tƣơng ứng.
Bản silicagel tráng sẵn F254 (Merk, Đức). Sephadex LH-20 (Amersham Biosciences, Thụy Điển), Silica gel 60 cho sắc ký cột k ch thƣớc 230-400 mesh.
Các hóa chất sử dụng thử hoạt tính chống gốc oxi hóa DPPH (2,2 - Diphenyl-1- picrylhydrazyl) của hãng Sigma, Mỹ.
Các hóa chất dùng định tính polyphenol, flavonoid, glycoside trong mẫu chất: Thuốc thử Folin – Ciocalteu (Merck, Đức). Các hóa chất th ng thƣờng kh c, đảm bảo độ sạch cho các phản ứng định tính gồm AlCl3, FeCl3, CH3COOK, NaOH, HCl, H2SO4,...
Hóa chất đƣợc sử dụng dựng đƣờng chuẩn gồm: axit galic (Canada), Quercetin (Viện dƣợc liệu).
2.3. Thiết bị thí nghiệm
- Máy cơ quay chân không Stuart RE300DB (Anh) - Tủ hút LabTech LFH 2150 (LabTech – Hàn Quốc) - Máy ly tâm Sigma 3K30 (Sartorius - Đức)
- pH/ion meter của (Horiba - Nhật Bản) - Tủ sấy (Memmert - Đức)
- Cân Kern (Satorius–Đức) - Cân phân tích (Presica- Ý) - M y khuấy từ (IKA RET–Đức)
- Đèn tử ngoại hai bƣớc sóng 245nm và 368nm (Việt Nam)
- Hệ thống sắc ký lỏng dùng cho phân tích phân tử sinh học (Agilent 1260 Infinity Bio-Inert Quaternary LC System hãng Agilent Technologies, Đức). Phần mềm OpenLAB CDS Chemstation, OpenLAB CDS Data Analysis.
- Việc xử lý mẫu đƣợc tiến hành trên các thiết bị: máy siêu âm Elmasonic S- 100; máy lọc chân kh ng, cân phân t ch, m y đo pH, cối nghiền mẫu. Các dụng cụ thủy tinh (bình định mức, pipet, cối nghiền...), đồ tiêu hao (giấy lọc, màng lọc, đầu hút,..) đạt chất lƣợng dùng cho phân t ch đƣợc mua công ty TNHH TEKCO Việt Nam.
2 4 Phƣơn pháp n hiên cứu
2.4.1. Phƣơn pháp định tính các nhóm chất của thực vật bằng phản ứng màu
Áp dụng c c phƣơng ph p định t nh x c định sự có mặt của các nhóm chất theo các tài liệu [1,2].
Phản ứng định tính glycosid
Cân 5g bột dƣợc liệu cho vào bình nón dung tích 250 ml. Thêm 100 ml ethanol 25% rồi ngâm trong 24 giờ. Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ dung tích 100ml. Thêm vài ml chì acetat 30%, khuấy đều. Để lắng, lọc dịch vào một cốc có mỏ dung tích 100 ml. Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào một ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat. Nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm tiếp chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại và tiếp tục thử đến khi dịch lọc khơng cịn tủa với chì acetat. Chuyển dịch lọc vào một bình gạn dung tích 100 ml. Lắc dịch chiết với hỗn hợp cloroform / ethanol (4:1), lắc 2
lần, mỗi lần 8 ml. Gạn thu dịch chiết. Gộp các dịch chiết cloroform và loại nƣớc bằng natri sulfat khan. Đem c c ch thủy đến khô. Cắn thu đƣợc đem tiến hành làm các phản ứng định tính.
Phản ứng Liebermann – Burchard: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn. Nghiêng ống 45o. Thêm từ từ theo thành ống 0,5ml H2SO4đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Kết quả: Ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện một v ng m u t m đỏ (phản ứng dƣơng t nh).
Phản ứng Baljet: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90%.
Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha (1 phần dung dịch axit picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%). So sánh màu sắc với ống chứng là ống khơng có cắn glycosid tim. Kết quả: Ống thử có m u đỏ cam kh ng đậm hơn ống chứng (phản ứng âm tính).
Phản ứng Legal: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ 1 giọt thuốc thử natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%. Lắc đều sẽ xuất hiện m u đỏ cam. So sánh màu sắc với ống chứng là ống khơng có cắn glycoside tim. Kết quả: Ống thử có m u đỏ cam kh ng đậm hơn ống chứng là phản ứng âm tính [2].
Phản ứng Keller – Kiliani: Cho vào ống nghiệm chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol
90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha trong axit acetic. Lắc đều và cho từ từ theo thành ống 0,5ml axit sulfuric đặc, tránh trộn chất lỏng trong ống. Kết quả: Ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện v ng m u đỏ tím – phản ứng dƣơng t nh.
Định tính saponin: Cho 1g bột dƣợc liệu vào ống nghiệm. Thêm 10ml nƣớc. Lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm trong 5 phút. Để yên và quan sát hiện tƣợng tạo bọt. Kết quả: Xuất hiện cột bọt không bền sau khi ngừng lắc 45 phút – phản ứng âm tính.
Định tính tanin: Tiến hành: Cho 2g bột mẫu vào ống nghiệm, thêm 10ml nƣớc
cất. Đun s i trực tiếp 5 phút. Lọc qua giấy lọc gấp nếp. Lấy dịch lọc chia làm 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml, đem l m c c phản ứng định tính.
Phản ứng với protein: Ống nghiệm 1: Thêm vào 1 giọt dung dịch gelatin 1% mới pha. Kết quả: Ống nghiệm không xuất hiện kết tủa bơng trắng – phản ứng âm tính.
Phản ứng với ion kim loại nặng
Ống nghiệm 2: Thêm vào vài giọt FeCl3 5%. Kết quả: Ống nghiệm không xuất hiện kết tủa xanh đen – phản ứng âm tính.
Ống nghiệm 3: Thêm vào vài giọt chì acetat 10%. Kết quả: Ống nghiệm xuất hiện kết tủa bông – phản ứng dƣơng t nh.
Định tính đường khử
Cân 2g mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 10ml nƣớc cất, đun s i v i phút. Lọc qua giấy lọc vào 1ống nghiệm khác. Thêm 2ml dung dịch thuốc thử Felling. Đun c ch thủy sôi vài phút.
Kết quả: Ống nghiệm xuất hiện kết tủa đỏ gạch – phản ứng dƣơng t nh.
Định tính polysaccharid
Lấy 2g mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 10ml nƣớc cất. Đun s i c ch thủy vài phút. Lọc lấy dịch. Cho vào 3 ống nghiệm:
Ống 1: 4ml dịch chiết + 5 giọt thuốc thử Lugol. Ống 2: 4ml nƣớc cất + 5 giọt thuốc thử Lugol. Ống 3: 4ml dịch chiết.
Kết quả: Màu của ống 1 nhạt hơn m u ống 2, màu ống 2 nhạt hơn ống 3 là phản ứng âm tính.
Định tính axit amin
Lấy 2g mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 10ml nƣớc cất, đun s i v i phút. Lọc qua giấy lọc vào 1 ống nghiệm khác. Thêm vài giọt thuốc thử Ninhydrin 3%. Đun cách thủy sôi vài phút. Kết quả: Ống nghiệm xuất hiện màu xanh là phản ứng dƣơng tính.
Định tính flavonoid
Lấy 2g mẫu cho vào bình nón dung t ch 50ml. Thêm 20ml ethanol 90%. Đun cách thủy sôi trong vài phút. Lọc nóng. Dịch chiết đem tiến hành các phản ứng định tính.
Phản ứng với kiềm
Bƣớc 1: Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ. Thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% sau đó thêm 1ml nƣớc cất. Kết quả: Ống nghiệm xuất hiện tủa vàng.
Bƣớc 2: Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc. Hơ kh rồi để lên miệng lọ amoniac đặc đã đƣợc mở nút. Nhỏ một giọt khác lên giấy lọc để so sánh. Kết quả: Màu vàng của vết dịch chiết tăng lên là phản ứng dƣơng tính.
Phản ứng với FeCl3
Tiến hành: Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm. Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%. Kết quả: Xuất hiện kết tủa xanh đậm (phản ứng dƣơng t nh).
Phản ứng diazo hóa
Tiến hành: Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch kiềm (dung dịch NaOH, Na2CO3), thêm vài giọt thuốc thử diazo mới pha, lắc đều, đun nóng trên nồi cách thủy trong vài phút. Kết quả: Xuất hiện m u đỏ – phản ứng dƣơng t nh.
Định tính alkaloid
Cân 5g bột dƣợc liệu, cho vào bình nón dung tích 50ml, thấm ẩm bằng dung dịch ammoniac đặc. Đậy kín khoảng 30 phút. Cho 15ml chloroform lắc đều trong 1giờ.Lọc lấy dịch chiết cho vào bình gạn. Lắc tiếp 2 lần, mỗi lần với 10ml dung dịch H2SO4 1N. Để phân lớp, gạn lấy dịch chiết axit, chia đều vào các ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1ml. Nhỏ vào từng ống nghiệm 2 - 3 giọt lần lƣợt các thuốc thử sau:
Ống 1: Thuốc thử Mayer. Xuất hiện kết tủa trắng là phản ứng dƣơng t nh. Ống 2: thuốc thử Bouchardat. Xuất hiện kết tủa nâu là phản ứng dƣơng t nh. Ống 3: Thuốc thử Dragendorff. Xuất hiện kết tủa đỏ cam là phản ứng âm tính.
Định tính chất béo, steroid
Tiến hành: Lấy 5g mẫu v o bình nón dung t ch 50ml, đổ ngập ether dầu hỏa, bọc kín, ngâm 24 giờ. Lọc qua giấy lọc thu dịch lọc. Chia dịch lọc để làm các thí nghiệm định t nh nhƣ sau:
Định tính chất béo
Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên mảnh giấy trắng, sấy nhẹ cho bay hết hơi dung m i. Kết quả: Để lại vết mờ trên giấy là phản ứng dƣơng t nh.
Định tính steroid
Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, cô cách thủy đến cắn. Thêm vào ống nghiệm khoảng 1ml anhydrid acetic, lắc kỹ cho tan hết cắn. Để nghiêng ống nghiệm 45o, thêm từ từ H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm.
Kết quả: Mặt phân cách giữa 2 lớp chất lỏng có v ng t m đỏ, lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá là phản ứng dƣơng t nh.
2.4.2. Phƣơn pháp chiết xuất hỗ trợ siêu âm thu dịch chiết dùng chophân tích HPLC, TLC và hoạt tính sinh học
Nguyên liệu dạng bột đƣợc cân 1g cho vào ống falcon (loại 50ml). Tiếp theo, dùng ống đong thêm đủ 25 ml dung môi methanol và voltex mẫu trong 10 phút. Sau đó, siêu âm mẫu ở nhiệt độ 65oC trong 30 phút.
Sau siêu âm, sử dụng giấy lọc để thu dịch chiết. Phần bã đƣợc thêm 25ml methanol, tiếp tục siêu âm lần 2 ở điều kiện và thời gian nhƣ trên. Gộp dịch lọc cho vào bình chiết, ngâm 30 phút. Sau đó nhỏ giọt, thu dịch. Lọc và gộp các dịch chiết, lọc lại thu dịch trong. Dịch chiết đã lọc đƣợc bảo quản ở nhiệt độ khoảng 4oC dùng cho các nghiên cứu tiếp theo.
- Xử lý mẫu dịch chiết sử dụng cho phân tích HPLC và thủy phân: Dịch chiết đƣợc lấy chính xác 100µl, thêm đủ lƣợng MeOH thành 1ml dịch chiết pha loãng. Dịch chiết pha loãng đƣợc sử dụng phân tích HPLC trƣớc và sau khi thủy phân trong HCl
2.4.3.Phƣơn pháp thủy phân mẫu dịch chiết trong HCL
Đƣợc thực hiện theo quy trình (hình 2.1) nhƣ sau
Hình 2.1. Quy trình thủy phân mẫu cho nghiên cứu TLC và HPLC 2.4.4 Phƣơn pháp sắc ký bản mỏn tron phân tích định tính dịch thủy phân 2.4.4 Phƣơn pháp sắc ký bản mỏn tron phân tích định tính dịch thủy phân
- Chuẩn bị: Bản mỏng silicagel, các mẫu dịch chiết, hóa chất và bình sắc ký.
Mẫu dịch chiết
Sấy khô tủa Lọc thua tủa Hỗn hợp thủy phân theo tỉ lệ: dịch chiết: H2O: HCl = 50:20:8
Bốc hơi ethanol Lọc thu dịch
Đun cách thủy ở 90oC, trong 60 phút ( 15 phút lắc 1 lần)
TLC Bỏ bã (nêu có)
Rửa tủa bằng nước cất về pH trung tính
Hịa lại với ethanol
Phân tích HPLC
-Tiến hành: Hoạt hóa bản mỏng Silicagel k ch thƣớc 7×10cm ở nhiệt độ 110oC trong 30 phút. Sau đó chấm sắc ký 5 mẫu thu đƣợc sau quá trình chuẩn bị nhƣ đã trình bày ở mục 2.4.2 và 2.4.3 bao gồm bụt giấm, rau đắng, rau m v đinh lăng.Sử dụng ống mao dẫn để hút các mẫu dịch chiết hoặc mẫu đã pha trong MeOH. Tiếp theo, tiến hành chấm các mẫu lên bản sắc ký đã k ch hoạt vàsấy nhẹ đến kh . Sau đó, chạy sắc ký bằng pha động và so sánh với mẫu quercetin chuẩn đã đƣợc chuẩn bị trƣớc.Các mẫu đƣợc chấm với nồng độ 10µl ở cùng mức độ pha loãng.
- X c định vết quercetin dựa trên vị trí vết xuất hiện ngang bằng với quercetin chuẩn, nhận diện bằng mắt thƣờng và buồng soi tử ngoại.
2.4.5. Xây dựng phƣơn pháp phân tích HPLC
2.4.5.1. Xử lý mẫu
- Mẫu dược liệu chuẩn hòe hoa:Tiến hành xử lý mẫu nhƣ đã trình b y ở phần
2.4.2. Sau đó, lấy 5ml dịch, lọc qua màng lọc 0,45µm, dịch lọc đƣợc bảo quản ở nhiệt độ 4o
C dùng cho phân tích HPLC.
- Với mẫu chuẩn quercetin: Cân 10mg mẫu quercetin chuẩn (dạng
C5H10O7.2H2O), cho v o bình định mức 10ml, h a tan v thêm đủ methanol tới vạch. Lấy chính xác 1,0ml dung dịch đó, pha lỗng bằng methanol, định mức 10 ml. Lấy chính xác 1,0ml dung dịch đó, tiếp tục pha lỗng bằng methanol, định mức 10 ml đƣợc dung dịch quercetin mẫu chuẩn nồng độ 10µg/ml. Lọc qua màng lọc k ch thƣớc 0,45µm, dịch lọc bảo quản ở nhiệt độ 4oC dùng cho phân tích HPLC.
- Xử lý mẫu cho thí nghiệm thêm chất chuẩn quercetin vào dịch chiết hoa hòe:
+ Mẫu 1: Lấy chính xác dung dịch quercetin chuẩn (nồng độ 10µg/ml, pha trong methanol) thêm 0,5ml methanol, đƣợc thể tích 1 ml.
+ Mẫu 2: Lấy chính xác 0,5ml quercetin chuẩn (nồng độ 10µg/ml, pha trong methanol) và 0,5ml dịch chiết methanol của hoa hòe, trộn lẫn đƣợc hỗn hợp có thể tích 1ml.
+ Mẫu 3: Lấy chính xác 0,5ml dịch chiết methanol của hoa hòe, thêm 0,5ml methanol đƣợc thể tích 1 ml.
- Xử lý mẫu quercetin dùng cho khảo sát sơ b h m lượng theo phương pháp đường chuẩn: Pha trong MeOH quercetin hydrat ở các nồng độ 0,1mg/ml, 0081mg/ml,
0,41mg/ml, 0,008mg/ml, 0,005mg/ml v 0,003mg/ml để xây dựng đƣờng chuẩn HPLC dùng cho khảo s t so s nh sơ bộ h m lƣợng giữa các dịch chiết.
2.4.5.2. Nghiên cứu thiết lập phương pháp HPLC phù hợp cho xác định quercetin trực tiếp từ dịch chiết và dịch thủy phân
- Mẫu nghiên cứu đƣợc phân tách trên cột pha đảo ZORBAX SB-C18 (Agilent); k ch thc 4,6 ì150mm, c ht 5àm. p suất có thể điều chỉnh 0-400bar. Nhiệt độ phân tách 25oC. Tốc độ dòng 0,5ml/phút. Thời gian phân tích khơng q 25 phút.
- Tiêm mẫu [10]: tiêm tự động lần lƣợt với thể tích là 10µl, 15µl, 20µl và 25µl để lựa chọn thể tích tiêm phù hợp cho hệ thống sắc ký.
- Pha động: Trên cơ sở tỉ lệ tham khảo [16,17] tạo kênh C pha sẵn có thành phần và tỉ lệ là methanol: acetonitril: H2O = 40:15:45 chứa 1% axit axetic. Tiến hành khảo sát rửa giải theo cách thức đẳng dòng isocratic với tỉ lệ phối trộn khác nhau của c c kênh (kênh A/C/D) trong đó kênh A l methanol, kênh D l acetonitril, kênh C giảm dần thể t ch. Trong đó kênh D sẽ ƣu tiên hơn kênh A về thể tích khi phối trộn để giảm áp suất. Sáu hệ khảo sát có tỉ lệ nhƣ sau: hệ 1(0/100/0), hệ 2 (10/80/10), hệ 3(10/70/30), hệ 4 (15/65/20), hệ 5 (10/60/30), hệ 6 (20/50/30).
- Đầu dò dãy diot quang (diode array detector-DAD) phát hiện quercetin: Quét phổ đồng thời ở 4 bƣớc sóng 283nm, 330nm, 367nm và 370nm khảo s t, x c định bƣớc sóng phù hợp. Từ kết quả nghiên cứu đó, sẽ x c định đƣợc điều kiện phân tích phù hợp cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.4.6 Phƣơn pháp thử hoạt tính thu dọn gốc tự do DPPH
- Ngun tắc: Hoạt tính chống oxi hóa của hoạt chất sinh học thể hiện ở phản ứng làm mất màu của dung dịch DPPH,đƣợc x c định bằng c ch đo quang ở bƣớc sóng 517nm [42].
- Chuẩn bị
+ Chuẩn bị mẫu cần phân tích: pha lỗng mẫu với dung mơi thích hợp, đƣa về