Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. Kết quả phân tích TLC của các dịch chiết trƣớcvà sau khi thủy phân
Bảng 3.6. Định tính quercetin ở dịch chiết MeOH trƣớcvà sau thủy phân bằng HCL TT
Tên mẫu
Định tính dịch chiết bằn
TLC so với chuẩn quercetin Kết luận
Trƣớc khi thủy phân
Sau khi thủy phân bằng HCL
1 Hoa hòe + ++ Có cả trƣớc v sau thủy phân
2 Rau đắng - + Có sau khi thủy phân
3 Bụp giấm - + Có sau khi thủy phân
4 Rau má - + Có sau khi thủy phân
5 Đinh lăng - + Có sau khi thủy phân
Chú thích: + phản ứng dƣơng t nh, - phản ứng âm tính
Theo bảng 3.6, khi phân tích ở nồng độ10µl (cùng mức độ pha lỗng) với giới hạn phát hiện của kĩ thuật TLC, nhận diện bằng cảm quanđã cho thấy tất cả các mẫu sau khi thủy phân đều có quercetin. Tuy nhiên, đối với mẫu trƣớc thủy phân, kĩ thuật TLC chỉ phát hiện đƣợc quercetin tự do (dạng aglycol) trong mẫu dịch chiết hoa hòe. Trong các mẫu sau thủy phân bằng HCL khi phân tích bằng kĩ thuật TLC, mẫu hoa hòe cho vết ngang với vết quercetin ở mức độ rộng v đậm hơn c c mẫu còn lại.
Kết quả bƣớc đầu cho thấy, trong nghiên cứu này dịch chiết hoa hòe (trong MeOH) có thể có mức độ quercetin (dạng liên hợp và tự do) là nhiều hơn c c dịch chiết của 4 mẫu thực vật còn lại. Kết quả này sẽ tiếp tục đƣợc làm rõ ở các nghiên cứu tiếp theo.
3.3. Kết quả khảo sát DPPH và năn lực khử của các dịch chiết thực vật 3.3.1. Hoạt tính DPPH
Các mẫu dịch chiết đƣợc tiến h nh đ nh gi khả năng DPPH. C c nồng độ đƣợc thử nghiệm từ 0,1 đến 1,0 mg/ml. Kết quả thu đƣợc trình bày trên bảng 3.7.
Bảng 3.7. Đ nh gi khả năng DPPH của dịch chiết các mẫu TT Tên mẫu TT Tên mẫu Nồn độ (m /ml) Khả năn khử DPPH (%) 0,1 0,25 0,5 0,75 1,0 1 Hoa hòe 75,3 75,5 76,73 75,74 74,75 2 Rau đắng 5,09 74,32 77,87 78,71 79,12 3 Bụp giấm 46,35 65,14 78,92 77,45 74,95 4 Rau má 7,75 25,89 32,57 41,55 45,93 5 Đinh lăng 15,66 18,58 26,09 34,03 43,43 Kết quả nghiên cứu cho thấy với nồng độ 0,1% dịch chiết hoa hịe có giá trị OD thấp nhất 0,1 tƣơng đƣơng với giá trị DPPH là cao nhất 75,3%. Các mẫu còn lại ở nồng độ 0,1 mg/ml thì rau đắng và bụp giấm l tƣơng đƣơng nhau trong khi thấp nhất l Rau m v Đinh lăng.
Với các nồng độ cao hơn khả năng DPPH của hoa h e l kh ng thay đổi nhiều trong khi ở các mẫu cịn lại thì hoạt t nh tăng thêm đ ng kể đặc biệt là mẫu dịch Rau má và Đinh lăng. Rau m từ 17,75% ở nồng độ 0,1 mg/ml tăng lên 41,55% ở nồng độ 0,75 mg/ml tƣơng tự l Đinh lăng từ 15,66% tăng lên mức 34,06%. Tuy vậy so với các mẫu thí nghiệm thì hoạt tính DPPH của hoa hịe vẫn là cao nhất và ổn định nhất.
Hoạt tính DPPH có liên quan đến h m lƣợng các chất thực vật thứ sinh nên việc hoa hịe có hoạt tính cao so với các thực vật thí nghiệm khác có thể do h m lƣợng flavonoid nói chung v quercetin nói riêng cao. Đây cũng l một điều kiện để chúng tơi lựa chọn hoa hịe cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.3.2. Khảo sát khả năn lực khử của các mẫu thực vật
Bảng 3.8. Khả năng lực khử của các mẫu thí nghiệm
TT Tên mẫu Nồn độ (m /ml) Năn lực khử 1,0 0,75 0,5 0,25 0,1 1 Hoa hòe 1,314 1,075 0,887 0,554 0,444 2 Rau đắng 0,514 0,415 0,341 0,265 0,189 3 Bụp giấm 0,417 0,363 0,302 0,239 0,193 4 Rau má 0,316 0,271 0,211 0,176 0,084 5 Đinh lăng 0,412 0,353 0,299 0,221 0,174
Đ nh gi về năng lực khử của các mẫu (bảng 3.8) cho thấy với nồng độ càng cao thì năng lực khử cũng tỉ lệ thuận. Trong các mẫu thí nghiệm cao nhất ở dịch chiết hoa hòe, tiếp theo l rau đắng và bụp giấm và thấp nhất l rau m v đinh lăng. Ở nồng độ thí nghiệm thấp nhất l 0,1 mg/ml năng lực khử của hoa hòe cao gấp khoảng 2,5-3 lần so với các mẫu cịn lại. Đây l kết quả lần đầu thí nghiệm về năng lực khử từ dịch chiết của các mẫu thực vật trong nghiên cứu này.
Hoa hịe có hoạt tính cao nhất so với các mẫu cịn lại về năng lực khử và đƣợc chúng tôi lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.3.3. Khảo sát điều kiện phân tích HPLC trên mẫu dƣợc liệu chuẩn hoa hòe
Nghiên cứu đƣợc tiến hành trên mẫu dƣợc liệu hoa hòe chuẩn do Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ƣơng cung cấp. Mẫu dƣợc liệu và mẫu quercetin chuẩn đƣợc xử lý theo c c phƣơng ph p đã nêu ở chƣơng 2.Từ các kết quả nghiên cứu trên cho thấy trong số các dịch chiết thực vật nghiên cứu dịch chiết hoa hoè có khả năng DPPH v năng lực khử có hoạt tính mạnh nhất. Do đó, trong phần này chúng tơi tập trung vào mục tiêu là phân tách và phát hiện quercetin tự do trong dịch chiếtMeOH, trƣớc khi thủy phân l m cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo.
Quercetin có tính axít yếu với pKa1 = 5,87 và pKa2 = 8,48 [9] với pha động lựa chọn có pH 3-4 sẽ thuận tiện cho quá trình phân tách khi rửa rải [7]. Hiện nay, khuynh hƣớng sử dụng pha động không chứa dung dịch đệm ng y c ng gia tăng để tránh gây
mịn hệ thống sắc ký [20] vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi sẽ thiết lập pha động chỉ chứa axít axetic khơng có hệ đệm để phân tách quercetin.
Kết quả xác định bước sóng, khoảng thời gian lưu đỉnh chiếm ưu thế, đỉnh quan tâm thể hiện ở hình 3.1. Việc khảo sát mẫu chuẩn và mẫu thử đƣợc bắt đầu thực
hiện với hệ pha động 1, thể tích tiêm mẫu 10µl, áp suất trung bình 30bar, thời gian phân t ch 25 phút để x c định bƣớc sóng, định tính quercetin trong mẫu thử so với chuẩn. Kết quả thu đƣợc ở hình 1a cho thấy khi chạy mẫu chuẩn với hệ 1 thì sự đ p ứng tín hiệu của quercetin chuẩn tốt nhất tại bƣớc sóng λ=370 nm. Kết quả n y cũng phù hợp với một số tác giả khi tiến hành phát hiện quercetin trong mẫu nguyên liệu quercetin (có độ tinh khiết cao), nhƣng với hệ pha động kh c [5,17,18]. Nhƣ vậy bƣớc sóng λ=370 nm đƣợc lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
Tiến hành phân tách mẫu thử dịch chiết hoa hịe, phân tích tại bƣớc sóng lựa chọn λ=370 nm cùng điều kiện nhƣ mẫu chuẩn ta thu đƣợc hình 3.1b. Trên hình 3.1b xuất hiện đỉnh chiếm ƣu thế, l đỉnh của chất có sự đ p ứng tín hiệu DAD cao nhất. Theo phiếu kiểm so t tƣơng ứng có thể khẳng định chất đó ch nh l rutin. C c đỉnh của chất ph a sau đƣợc x c định trong tổng thời gian phân tích 25 phút.
Hình 3.1. Kết quả đ p ứng tín hiệu khi rửa giải theo hệ 1
Chú thích: (1a) Phổ DAD-3D tại 4 bƣớc sóng trên mẫu chuẩn quercetin (pha
động hệ 1); (1b) Sắc ký đồ bƣớc sóng λ=370 nm của mẫu hoa h e (pha động hệ 1). Hoa hòe trong nghiên cứu n y có h m lƣợng rutin đƣợc tiêu chuẩn hóa là 21,1%, với cột phân t ch l pha đảo, rutin (đỉnh chiếm ƣu thế) do phân cực hơn quercetin sẽ có thời gian lƣu ngắn hơn nên sẽ đƣợc rửa giải ra trƣớc.
Trên hình 3.1b, chúng ta có thể thấy đỉnh ngay sau đỉnh chiếm ứu thế có thời gian lƣu khoảng 19 phút, kết hợp với kết quả quét phổ 3Dở hình 3.1a trên mẫu quercetin chuẩn đã từng bƣớc giúp x c định đỉnh nối tiếp ngay sau đỉnh rutin ở hình 3.9b có khả năng ch nh l quercetin, điều này sẽ đƣợc khẳng định chắc chắn khi tiến h nh phƣơng ph p thêm chất chuẩn. Tuy nhiên, kết quả sắc ký cho thấy thời gian lƣu của đỉnh quercetin cao, nên đỉnh bị dỗng. Vì vậy, trong nghiên cứu này cần phải khảo sát hệ pha động nhằm giảm thời gian lƣu của quercetin.
Kết quả xác định hệ pha đ ng thể hiện ở hình 3.2 và hình 3.3. Kết quả cho thấy
khi rửa giải bằng hệ 1, hệ 2, hệ 3 và hệ 4 khả năng t ch đỉnh quan tâm (quercetin) khỏi đỉnh chiếm ƣu thế (rutin, ph a trƣớc) là tốt nhất, thể hiện độ phân giải đều lớn hơn 1,5 và sắc ký đồ phân tách rõ. Còn hệ 5 và hệ 6 có độ phân giải thấp (nhỏ hơn 1,5) nên đỉnh quan tâm kh ng t ch đƣợc khỏi đỉnh chiếm ƣu thế (hình 3.2).
Đồng thời, kết quả thực nghiệm cũng cho thấy ở hệ 4, quercetin có thời gian lƣu nhỏ nhất trong 4 hệ tách tốt (tr= 10,98 phút, độ phân giải 2,45). Nhƣ vậy, hệ 4 (tỉ lệ A/C/D = 15/65/20) sẽ đƣợc lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.3. Sắc ký đồ mẫu thử (hoa hòe) tại λ = 370nm rửa giải theo hệ pha động tách
đƣợc lựa chọn (3a-hệ 4) v kh ng t ch đƣợc (3b-hệ 5).
Xác định thể tích tiêm mẫu:Trên cơ sở hệ pha động đã x c định, tiếp tục khảo
sát vịng tiêm mẫu ở các thể tích 10µl (V10), 15µl (V15), 20µl (V20), 25µl (V25) để đƣa ra thể tích phù hợp. Việc x c định thể tích tiêm mẫu đƣợc thực hiện trên cả mẫu chuẩn và mẫu thử. Trong kĩ thuật HPLC, bên cạnh thời gian lƣu sự đ p ứng tín hiệu đƣợc sử dụng để phân tích các chất đó l diện t ch đỉnh hoặc chiều cao đỉnh. Để xác định thể tích tiêm mẫu, chỉ tiêu đ nh gi lựa chọn là hiệu lực cột (số đĩa lý thuyết), hệ số kéo đu i của đỉnh.
Trên mẫu thử, chúng t i cũng tiến hành kiểm tra thêm độ phân giải của đỉnh quan tâm về ph a trƣớc và phía sau
Hình 3.4. Kết quả khảo sát thể tích tiêm mẫu mẫu chuẩn quercetin (4a) và mẫu thử
Kết quả khảo sát thể tích tiêm trên mẫu chuẩn thể hiện ở hình 3.4a cho thấy các thể tích tiêm mẫu đều có hiệu lực cột đạt yêu cầu (N> 2000). Ở thể tích tiêm V10 đỉnhbị kéo đu i mạnh, thể hiện ở giá trị hệ số kéo đu i nằm ngoài khoảng giới hạn cho phép. Ở thể tích V25 các thơng số sắc ký đều đạt, nhƣng kết quả sắc ký đồ cho thấy có xuất hiện đỉnh phụ điều đó cho thấy cột đã bị bão hịa, khơng có khả năng t ch hết. Ở thể t ch V15 v V20 t nh đối xứng đều đạt u cầu, trong đó thể tích V20 cho kết quả tốt nhất, do các hệ số phản ảnh t nh đối xứng của đỉnh đạt gần 1. Với kết quả thu đƣợc ở thể tích V15 và V20, chúng tơi tiến hành khảo sát trên mẫu thử, kết quả thu đƣợc hình 3.4b đã khẳng định thể tích tiêm mẫu V bằng 20µl đỉnh có t nh đối xứng gần 1 nhất, phù hợp cho các nghiên cứu tiếp theo.
Kết quả thu đƣợc hình 3.4 thấy hệ 1 cho khả năng phân t ch hiệu quả quercetin ra khỏi rutin, điều này là phù hợp với kết quả nghiên cứu đã c ng bố [16]. Tuy nhiên có sự khác biệt lớn trong thời gian lƣu. Trong nghiên cứu này, với hệ tham khảo (hệ 1, 100% hỗn hợp C) đã cho thời gian lƣu của quercetin trên 19 phút so với nghiên cứu đã cơng bố l 5 phút [16]. Điều này có thể giải thích do sự khác nhau ở cột phân tách, do h m lƣợng rutin quá lớn, và có thể là do áp suất đầu cột. Vì vậy để tiếp tục giảm thời gian lƣu l m cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo, trong nghiên cứu này chúng tôi chúng t i đã tăng p suất từ 30 lên 35bar. Kết quả thực nghiệm cho thấy thời gian lƣu đã giảm xuống khoảng 8 phút (hình 3.5).
Thời gian phân tích phụ thuộc nhiều vào mục tiêu của việc tiến hành phân tích mẫu, bao gồm có thời gian tách, phát hiện các chất, thời gian rửa cột. Với cột phân tách trong nghiên cứu này là ZORBAX SB-C18 có thể tích 2,5ml, với tốc độ 0,5ml/phút thì sẽ cần tối thiểu 5 phút để rửa cột sau phân tích.
Thời gian lƣu của đỉnh quercetin lựa chọn trong nghiên cứu này khoảng 8 phút, kết quả thực nghiệm ở hình 5 cho thấy sẽ cần khoảng 11 phút cho phân tách, phát hiện các chất v 5 phút để rửa cột. Vì vậy trong nghiên cứu này thời gian phân tích 16 phút là phù hợp.
Khẳng định quercetin trong dịch chiết hoa hòe bằng phương pháp thêm chất chuẩn
Trên cơ sở kết quả thu đƣợc, tiến hành phân tích các mẫu 1, mẫu 2 và mẫu 3 trong cùng điều kiện, ở bƣớc sóng khảo s t để phát hiện và khẳng định đỉnh quercetin. Kết quả thu đƣợc trên hình 6 cho thấy mẫu hỗn hợp dịch chiết hoa hòe thêm chuẩn
(mẫu 2) và mẫu dịch chiết hoa hòe pha thêm methanol (mẫu 3) có số đỉnh sau đỉnh chiếm ƣu thế l nhƣ nhau (có 2 đỉnh, kh ng có thêm đỉnh mới), trong khi đó trên sắc ký đồ mẫu 1 (mẫu chuẩn pha methanol) có duy nhất 1 đỉnh. Điều đó cho thấy, trong mẫu 2, đỉnh của quercetin chuẩn thêm vào sẽ trùng với 1 trong c c đỉnh sau đỉnh chiêm ƣu thế của mẫu 2. Để x c định đỉnh trùng lặp đó trên sắc ký đồ, chúng tơi tiến hành so sánh sự đ p ứng tín hiệu DAD ở mẫu 2 và mẫu 3 so với mẫu 1.
Kết quả trên hình 3.5b và 3.5c cho thấy sự đ p ứng tín hiệu ở 4 bƣớc sóng của đỉnh nối tiếp ngay sau đỉnh chiếm ƣu thế trong mẫu 2 và mẫu 3 có thời gian lƣu trùng với thời gian lƣu của quercetin trong mẫu 1 (hình 3.5a).
Đồng thời sự đ p ứng tín hiệu DAD của đỉnh quan tâm ở cả 4 bƣớc sóng trong mẫu 2 là cao nhất, tƣơng đƣơng với tổng sự đ p ứng tín hiệu DAD của đỉnh quan tâm ở mẫu 1 và mẫu 3. Kết quả thu đƣợc đã khẳng định chắc chắn đỉnh quan tâm trong mẫu thử chính là quercetin.
Kết quả quét phổ ở cả 4 bƣớc sóng đã một lần nữa khẳng định, bƣớc sóng λ=370 nm đƣợc lựa chọn là phù hợp cho nghiên cứu x c định quercetin trong dịch chiết hoa hịe.
Hình 3.5. Ảnh 3D quét phổ ở 4 bƣớc sóng trong điều kiện có chuẩn quercetin
3.3.4. Đánh iá độ ổn định củ phƣơn pháp HPLC đƣợc thiết lập
Với kết quả khảo s t đã giúp chúng t i thiết lập đƣợc điều kiện phân tích phù hợp nhƣ sau: Cột phân t ch pha đảo ZORBAX SB-C18, pha động có tỉ lệ phù hợp là methanol: acetonitril: hỗn hợp C (15/20/65, % thể tích, pH = 3,63) với hỗn hợp C đƣợc pha bao gồm methanol: acetonitril: H2O = 40:15:45 chứa 1% axit axetic (% thể
tích), rửa giải isocratic; tốc độ dịng 0,5ml/phút, thể tích tiêm mẫu 20µl, phân tích ở nhiệt độ 25oC, thời gian phân t ch l 16 phút, bƣớc sóng phân tích thích hợp là 370nm. Áp suất phân tách trung bình 35bar.
Để áp dụng phƣơng ph p HPLC đã thiết lập nhằm khảo s t sơ bộ h m lƣợng quercetin trong dịch chiết, điều kiện phân tích HPLC sẽ đƣợc chúng tơi tiếp tục đ nh gi độ ổn định trên mẫu thử là dịch chiết từ dƣợc liệu hoa hòe chuẩn. Kết quả thể hiện ở bảng 3.9 và hình 3.6 cho thấy thời gian lƣu của quercetn là tr = 8,84 ± 0,05 (phút) (ở 35bar), độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD (%) của diện t ch đỉnh, chiều cao đỉnh, hệ số kéo đu i đều nhỏ hơn 1%.
Thiết bị phân tích HPLC trong nghiên cứu này có thể thay đổi áp suất đầu vào. Vì vậy, chúng t i đã tiếp tục thay đổi áp suất đầu cột lên các mức khoảng 56, 57, 58,59 bar, thì thời gian lƣu đã giảm xuống cịn khoảng hơn 4 phút (hình 3.7) v độ ổn định của hệ thống sắc ký vẫn đảm bảo. Điều này cho phép trong q trình phân tích các mẫu dịch chiết có thể tăng p suất đầu cột để rút ngắn thời gian lƣu thuận lợi cho q trình phân tách.
Hình 3.6. Thơng số sắc ký qua 5 lần thí nghiệm
Bảng 3.9. Độ ổn định của hệ thống sắc ký đối với dịch chiết hoa hòe
Thời gian lƣu ở áp suất 35bar(phút) Diện tích đỉnh(mm2 ) Chiều cao đỉnh (cm) Hệ số kéo đu i Trung bình 8,835 1471,406 55,792 0,999 Độ lệch chuẩn 0,037 10,015 0,299 0,004
Tỷ lệ RSD 0,419 0,681 0,536 0,400
Hình 3.7. Thời gian lƣu của đỉnh quercetin chuẩn khi thay đổiáp suất đầu cột
từ mức 35bar lên mức khoảng 59-60bar
Nhƣ vậy, các kết quả thu đƣợc đã khẳng định điều kiện sắc ký HPLC thiết lập đƣợc đảm bảo t nh đặc hiệu trong phân tách và phát hiện quercetin trong dịch chiết, đ p ứng tốt về tính chính xác, tính thích hợp hệ thống HPLC. Kết quả thu đƣợc này sẽ đƣợc sử dụng để đ nh gi sơ bộ quercetin trong dịch chiết MeOH trƣớc và sau khi thủy phân bằng HCL, l m cơ sở cho các quá trình thu nhận quercetin từ thực vật.