Hình 3.3. Sắc ký đồ mẫu thử (hoa hịe) tại λ = 370nm rửa giải theo hệ pha động tách
đƣợc lựa chọn (3a-hệ 4) v kh ng t ch đƣợc (3b-hệ 5).
Xác định thể tích tiêm mẫu:Trên cơ sở hệ pha động đã x c định, tiếp tục khảo
sát vịng tiêm mẫu ở các thể tích 10µl (V10), 15µl (V15), 20µl (V20), 25µl (V25) để đƣa ra thể tích phù hợp. Việc x c định thể tích tiêm mẫu đƣợc thực hiện trên cả mẫu chuẩn và mẫu thử. Trong kĩ thuật HPLC, bên cạnh thời gian lƣu sự đ p ứng tín hiệu đƣợc sử dụng để phân tích các chất đó l diện t ch đỉnh hoặc chiều cao đỉnh. Để xác định thể tích tiêm mẫu, chỉ tiêu đ nh gi lựa chọn là hiệu lực cột (số đĩa lý thuyết), hệ số kéo đu i của đỉnh.
Trên mẫu thử, chúng t i cũng tiến hành kiểm tra thêm độ phân giải của đỉnh quan tâm về ph a trƣớc và phía sau
Hình 3.4. Kết quả khảo sát thể tích tiêm mẫu mẫu chuẩn quercetin (4a) và mẫu thử
Kết quả khảo sát thể tích tiêm trên mẫu chuẩn thể hiện ở hình 3.4a cho thấy các thể tích tiêm mẫu đều có hiệu lực cột đạt yêu cầu (N> 2000). Ở thể tích tiêm V10 đỉnhbị kéo đu i mạnh, thể hiện ở giá trị hệ số kéo đu i nằm ngoài khoảng giới hạn cho phép. Ở thể tích V25 các thơng số sắc ký đều đạt, nhƣng kết quả sắc ký đồ cho thấy có xuất hiện đỉnh phụ điều đó cho thấy cột đã bị bão hịa, khơng có khả năng t ch hết. Ở thể t ch V15 v V20 t nh đối xứng đều đạt u cầu, trong đó thể tích V20 cho kết quả tốt nhất, do các hệ số phản ảnh t nh đối xứng của đỉnh đạt gần 1. Với kết quả thu đƣợc ở thể tích V15 và V20, chúng tơi tiến hành khảo sát trên mẫu thử, kết quả thu đƣợc hình 3.4b đã khẳng định thể tích tiêm mẫu V bằng 20µl đỉnh có t nh đối xứng gần 1 nhất, phù hợp cho các nghiên cứu tiếp theo.
Kết quả thu đƣợc hình 3.4 thấy hệ 1 cho khả năng phân t ch hiệu quả quercetin ra khỏi rutin, điều này là phù hợp với kết quả nghiên cứu đã c ng bố [16]. Tuy nhiên có sự khác biệt lớn trong thời gian lƣu. Trong nghiên cứu này, với hệ tham khảo (hệ 1, 100% hỗn hợp C) đã cho thời gian lƣu của quercetin trên 19 phút so với nghiên cứu đã công bố l 5 phút [16]. Điều này có thể giải thích do sự khác nhau ở cột phân tách, do h m lƣợng rutin quá lớn, và có thể là do áp suất đầu cột. Vì vậy để tiếp tục giảm thời gian lƣu l m cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo, trong nghiên cứu này chúng tôi chúng t i đã tăng p suất từ 30 lên 35bar. Kết quả thực nghiệm cho thấy thời gian lƣu đã giảm xuống khoảng 8 phút (hình 3.5).
Thời gian phân tích phụ thuộc nhiều vào mục tiêu của việc tiến hành phân tích mẫu, bao gồm có thời gian tách, phát hiện các chất, thời gian rửa cột. Với cột phân tách trong nghiên cứu này là ZORBAX SB-C18 có thể tích 2,5ml, với tốc độ 0,5ml/phút thì sẽ cần tối thiểu 5 phút để rửa cột sau phân tích.
Thời gian lƣu của đỉnh quercetin lựa chọn trong nghiên cứu này khoảng 8 phút, kết quả thực nghiệm ở hình 5 cho thấy sẽ cần khoảng 11 phút cho phân tách, phát hiện các chất v 5 phút để rửa cột. Vì vậy trong nghiên cứu này thời gian phân tích 16 phút là phù hợp.
Khẳng định quercetin trong dịch chiết hoa hòe bằng phương pháp thêm chất chuẩn
Trên cơ sở kết quả thu đƣợc, tiến hành phân tích các mẫu 1, mẫu 2 và mẫu 3 trong cùng điều kiện, ở bƣớc sóng khảo s t để phát hiện và khẳng định đỉnh quercetin. Kết quả thu đƣợc trên hình 6 cho thấy mẫu hỗn hợp dịch chiết hoa hòe thêm chuẩn
(mẫu 2) và mẫu dịch chiết hoa hòe pha thêm methanol (mẫu 3) có số đỉnh sau đỉnh chiếm ƣu thế l nhƣ nhau (có 2 đỉnh, kh ng có thêm đỉnh mới), trong khi đó trên sắc ký đồ mẫu 1 (mẫu chuẩn pha methanol) có duy nhất 1 đỉnh. Điều đó cho thấy, trong mẫu 2, đỉnh của quercetin chuẩn thêm vào sẽ trùng với 1 trong c c đỉnh sau đỉnh chiêm ƣu thế của mẫu 2. Để x c định đỉnh trùng lặp đó trên sắc ký đồ, chúng tơi tiến hành so sánh sự đ p ứng tín hiệu DAD ở mẫu 2 và mẫu 3 so với mẫu 1.
Kết quả trên hình 3.5b và 3.5c cho thấy sự đ p ứng tín hiệu ở 4 bƣớc sóng của đỉnh nối tiếp ngay sau đỉnh chiếm ƣu thế trong mẫu 2 và mẫu 3 có thời gian lƣu trùng với thời gian lƣu của quercetin trong mẫu 1 (hình 3.5a).
Đồng thời sự đ p ứng tín hiệu DAD của đỉnh quan tâm ở cả 4 bƣớc sóng trong mẫu 2 là cao nhất, tƣơng đƣơng với tổng sự đ p ứng tín hiệu DAD của đỉnh quan tâm ở mẫu 1 và mẫu 3. Kết quả thu đƣợc đã khẳng định chắc chắn đỉnh quan tâm trong mẫu thử chính là quercetin.
Kết quả quét phổ ở cả 4 bƣớc sóng đã một lần nữa khẳng định, bƣớc sóng λ=370 nm đƣợc lựa chọn là phù hợp cho nghiên cứu x c định quercetin trong dịch chiết hoa hòe.