3.3.4. Đánh iá độ ổn định củ phƣơn pháp HPLC đƣợc thiết lập
Với kết quả khảo s t đã giúp chúng t i thiết lập đƣợc điều kiện phân tích phù hợp nhƣ sau: Cột phân t ch pha đảo ZORBAX SB-C18, pha động có tỉ lệ phù hợp là methanol: acetonitril: hỗn hợp C (15/20/65, % thể tích, pH = 3,63) với hỗn hợp C đƣợc pha bao gồm methanol: acetonitril: H2O = 40:15:45 chứa 1% axit axetic (% thể
tích), rửa giải isocratic; tốc độ dịng 0,5ml/phút, thể tích tiêm mẫu 20µl, phân tích ở nhiệt độ 25oC, thời gian phân t ch l 16 phút, bƣớc sóng phân tích thích hợp là 370nm. Áp suất phân tách trung bình 35bar.
Để áp dụng phƣơng ph p HPLC đã thiết lập nhằm khảo s t sơ bộ h m lƣợng quercetin trong dịch chiết, điều kiện phân tích HPLC sẽ đƣợc chúng tơi tiếp tục đ nh gi độ ổn định trên mẫu thử là dịch chiết từ dƣợc liệu hoa hòe chuẩn. Kết quả thể hiện ở bảng 3.9 và hình 3.6 cho thấy thời gian lƣu của quercetn là tr = 8,84 ± 0,05 (phút) (ở 35bar), độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD (%) của diện t ch đỉnh, chiều cao đỉnh, hệ số kéo đu i đều nhỏ hơn 1%.
Thiết bị phân tích HPLC trong nghiên cứu này có thể thay đổi áp suất đầu vào. Vì vậy, chúng t i đã tiếp tục thay đổi áp suất đầu cột lên các mức khoảng 56, 57, 58,59 bar, thì thời gian lƣu đã giảm xuống cịn khoảng hơn 4 phút (hình 3.7) v độ ổn định của hệ thống sắc ký vẫn đảm bảo. Điều này cho phép trong q trình phân tích các mẫu dịch chiết có thể tăng p suất đầu cột để rút ngắn thời gian lƣu thuận lợi cho quá trình phân tách.
Hình 3.6. Thơng số sắc ký qua 5 lần thí nghiệm
Bảng 3.9. Độ ổn định của hệ thống sắc ký đối với dịch chiết hoa hòe
Thời gian lƣu ở áp suất 35bar(phút) Diện tích đỉnh(mm2 ) Chiều cao đỉnh (cm) Hệ số kéo đu i Trung bình 8,835 1471,406 55,792 0,999 Độ lệch chuẩn 0,037 10,015 0,299 0,004
Tỷ lệ RSD 0,419 0,681 0,536 0,400
Hình 3.7. Thời gian lƣu của đỉnh quercetin chuẩn khi thay đổiáp suất đầu cột
từ mức 35bar lên mức khoảng 59-60bar
Nhƣ vậy, các kết quả thu đƣợc đã khẳng định điều kiện sắc ký HPLC thiết lập đƣợc đảm bảo t nh đặc hiệu trong phân tách và phát hiện quercetin trong dịch chiết, đ p ứng tốt về tính chính xác, tính thích hợp hệ thống HPLC. Kết quả thu đƣợc này sẽ đƣợc sử dụng để đ nh gi sơ bộ quercetin trong dịch chiết MeOH trƣớc và sau khi thủy phân bằng HCL, l m cơ sở cho các quá trình thu nhận quercetin từ thực vật.
3 3 5 Xác định quercetin trong dịch chiết mẫu thực vật trƣớc và sau thủy phân
3.3.5.1. Nhận diện đỉnh quercetin tự do trong dịch chiết bằng phương pháp HPLC
Cả 5 mẫu đều đƣợc tiến hành chiết xuất và thủy phân trong cùng điều kiện. Kết quả sắc ký đƣợc thể hiện trên các hình 3.8 đến hình 3.12.
Hình 3.9. Kết quả chạy mẫu đinh lăngtrƣớc thủy phân
Hình 3.10. Kết quả chạy mẫu hoa hịe trƣớc thủy phân
Hình 3.11. Kết quả chạy mẫu rau đắng biển trƣớc thủy phân
Hình 3.12. Kết quả chạy mẫu rau mátrƣớc thủy phân
Hình 3.13.Kết quả chạy HPLC mẫu quercetin chuẩn
Trong thí nghiệm này, với áp suất khởi đầu là khoảng 57bar, kết quả đối chiếu với mẫu quercetin chuẩn đối với 5 mẫu chúng tôi nhận thấy ở các mẫu hoa hòe, rau đắng biển có xuất hiện đỉnh trùng với thời gian lƣu của quercetin chuẩn là 4,8 phút.Trong đó, mẫu hoa hòe cho đỉnh có diện tích và chiều cao vƣợt trội. Kết quả phân tích HPLC là phù hợp với kết quả TLC.
3.3.5.2. Xác định sơ bộ hàm lượng quercetin trong dịch chiết nụ hoa hòe sau thủy phân
Phƣơng ph p HPLC đƣợc áp dụng để x c định sơ bộ h m lƣợng quercetin aglycol từ dịch chiết đã thủy phân n y theo phƣơng ph p chuẩn ngoại.Kết quả trình bày ở hình 3.14 và hình 3.15.
Hình 3.14. Kết quả chạy HPLC mẫu quercetin chuẩn
Hình 3.15. Kết quả chạy HPLC mẫu hoa hòe thủy phân
Trong nghiên cứu này, querctin có thời gian lƣu l tr= 4,3 phút và trong mẫu phân tích dịch thủy phân hoa hịe, đỉnh quercetin có diện tích đỉnh là 12798,31mAUs.
Từ đƣờng chuẩn (hình 3.16)x c định đƣợc nồng độ quercetin trong mẫu phân tích (V= 20µl từ dịch chiết 1g đã pha lỗng) là 76,08µg/ml.
KẾT LUẬN
1. Đã đ nh gi định tính các chất chuyển hóa thứ sinh có trong các mẫu hoa h e, rau đắng, đinh lăng, rau m v bụp giấm. Kết quả cho thấy các mẫu đều có chứa flavonoid và quercetin dạng liên hợp.
2. Đã đ nh gi khả năng khử gốc tự do, năng lực khử của các mẫu cho thấy mẫu dịch chiết hoa hịe có hoạt tính cao nhất.
3. Đã thiết lập đƣợc qui trình tách chiết quercetin dạng tự do trong dịch chiết nụ hoa của cây hòe (Sophora japonica L.) v x c định bằng phƣơng ph p sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. Với điều kiện HPLC thiết lập đƣợc, đã x c định đƣợc quercetin trong dịch chiết hoa hịe có thời gian lƣu 8,84 ± 0,05 (phút)ở 35bar và nồng độ quercetin trong mẫu phân tích (V= 20µl từ dịch chiết 1g đã pha lỗng) l 76,08µg/ml.
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục nghiên cứu phƣơng ph p tinh sạch quercetin từ dịch thủy phân hoa h e v đ nh gi độ tinh khiết quercetin thu nhận.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Bộ m n dƣợc liệu (2007), Thực tập dược liệu - Phần kiểm nghiệm bằng phương pháp hóa học, Trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội.
2. Nguyễn Văn Đ n, Nguyễn Viết Tựu, (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học
cây thuốc, NXB Y học.
3. Nguyễn Văn Đậu (2003), “Ứng dụng phƣơng ph p sắc ký lỏng hiệu năng cao pha ngƣợc (RP-HPLC) để phân t ch định lƣợng nhanh các hợp chất Phenol trong thực vật” i nghị hóa học tồn quốc lần thứ IV, tr.96-110.
4. Nguyễn Văn Đậu (2001), “Đóng góp v o việc nghiên cứu Flavonoid trong Hịe” Tạp chí dược học, số 304, tr. 13-14.
5. Ho ng Văn Tuấn, Phạm Hƣơng Sơn, Nguyễn Thị Hiền, Nguyễn Đình Luyện, Nguyễn Thanh Hảo, (2013),“Nghiên cứu tách chiết v x c định một số hoạt tính sinh học của dịch chiết flavonoid từ cây diếp cá (Houttuynia cordata thunberg) thu hái tại Hà Nội”, Tạp chí sinh học, 35 (3), tr. 183 -187.
6. Phạm Hoàng Hộ; Cây cỏ Việt Nam - tập 2; Nhà xuất bản Trẻ - 1999.
7. Nguyễn Cửu Nguyệt Huế (2016), Nghiên cứu hoạt tính sinh học và m t số tính
chất của quercetin tách từ hành tây Allium cepa L., Luận văn thạc sĩ khoa học,
Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN.
8. Th i Duy Thìn, Vũ Đức Lợi, Đặng Thị Ngọc Thƣ (2010), Nghiên cứu định lƣợng quercetin nguyên liệu bằng phƣơng ph p HPLC, Tạp chí Dược học, 411: 43-47.
9. Đo n Thị Ngọc Yến, Nguyễn Đức Tuấn, (2013). Định lƣợng đồng thời paracetamol, lorantadin và dextromethophan HBr trong chế phẩm đa th nh phần bằng phƣơng ph p sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dị dãy diod quang,
Tạp chí dược học, 441: 25-28.
Tiếng Anh
10. Ades TB (2009), Quercetin. American Cancer Society Complete Guide to Complementary and Alternative Cancer Therapies (2nd edition). American Cancer Society. ISBN 9780944235713.
11. Adams AM (2014), "Warning Letter to River Hills Harvest dba Elderberrylife". Inspections, Compliance, Enforcement, and Criminal Investigations, US FDA. 12. Ali Khoddam., et al (2013), Review: Techniques for Analysis of Plant Phenolic
Compound, Molecules, 18: 2328-2332.
13. Chirumbolo, S (2011), “Quercetin as a potential anti-allergic drug: which perspectives?” Iran J. Allergy Asthma Immunol., 10, pp. 139-140
14. Day AJ, Rothwell JA, Morgan R (2004), "Characterization of polyphenol metabolites". In Bao Y, Fenwick R. Phytochemicals in health and disease.
New York, NY: Dekker. pp. 50–67. ISBN 08247-4023-8
15. European Food Safety Agency (EFSA) NDA Panel (Dietetic Products, Nutrition and Allergies). "Scientific Opinion on the substantiation of health claims related to quercetin and protection of DNA, proteins and lipids from oxidative damage (ID 1647), "cardiovascular system" (ID 1844), "mental state and performance" (ID 1845), and "liver, kidneys" (ID 1846) pursuant to Article 13(1) of Regulation (EC) No 1924/2006". EFSA Journal. 9 (4): 2067–82. 16. Formica JV, Regelson W (1995), "Review of the biology of quercetin and
related bioflavonoids". Food and Chemical Toxicology. 33 (12): 1061–80. 17. Feitelson MA, Arzumanyan A, Kulathinal RJ, Blain SW, Holcombe RF,
Mahajna J, Marino M, Martinez-Chantar ML, Nawroth R, SanchezGI, Sharma D, Saxena NK, Singh N, Vlachostergios PJ, Guo S, Honoki K, Fujii H, Georgakilas AG, Bilsland A, Amedei A, Niccolai E, Amin A, Ashraf SS, Boosani CS, Guha G, Ciriolo MR, Aquilano K, Chen S, Mohammed SI, Azmi AS, Bhakta D, Halicka D, Keith WN, Nowsheen S (2015). "Sustained proliferation in cancer: Mechanisms and novel therapeutic targets". Seminars in
Cancer Biology. 35 Suppl: S25–54.
18. Fischer C, Speth V, Fleig-Eberenz S, Neuhaus G (1997), "Induction of Zygotic Polyembryos in Wheat: Influence of Auxin Polar Transport". The Plant Cell.
9(10): 1767–1780.
19. Gabriele DA (2015),“A flavonol with multifaceted therapeutic applications?”,
20. Graefe EU, Derendorf H, Veit M (1999),"Pharmacokinetics and bioavailability of the flavonol quercetin in humans". International Journal of Clinical Pharmacology and Therapeutics. 37 (5): 219–33.
21. Kressler, J.; Millard-Stafford, M.; Warren, G.L. (2011), “Quercetin and endurance exercise capacity: a systematic review and meta-analysis”. Med. Sci.
Sports Exerc., 43, pp.2396-2404.
22. Justesen U, Knuthsen P (2001). "Composition of flavonoids in fresh herbs and calculation of flavonoid intake by use of herbs in traditional Danish dishes".
Food Chemistry. 73(2): 245–50.
23. Juergenliemk G, Boje K, Huewel S, Lohmann C, Galla HJ, Nahrstedt A (2003). "In vitro studies indicate that miquelianin (quercetin 3-O-beta-D- glucuronopyranoside) is able to reach the CNS from the small intestine".
Planta Medica. 69(11): 1013–7.
24. Jung CH, Cho I, Ahn J, Jeon T.I., Ha TY. (2013), “Quercetin reduces high-fat diet-induced fat accumulation in the liver by regulating lipid metabolism genes”, Phytother. Res., 27, pp.139-143
25. Lee KM, Hwang M.K, Lee DE, Lee K.W, Lee HJ. (2010), “Protective effect of quercetin against arsenite-induced COX-2 expression by targeting PI3K in rat liver epithelial cells”, J. Agric. Food Chem, 58: 5815-5820.
26. Lee Fung Ang et al., (2014), HPLC method for simultaneous quantitative detection of quercetin and curcuminnoids in traditional Chinese Medicales,
Journal of Pharmacopunture, 17: 36-40.
27. Mitchell AE, Hong YJ, Koh E, Barrett DM, Bryant DE, Denison RF, Kaffka S (2007). "Ten-year comparison of the influence of organic and conventional crop management practices on the content of flavonoids in tomatoes". Journal
of Agricultural and Food Chemistry. 55 (15): 6154–9.
28. Maggiolini M, Vivacqua A, Fasanella G, Recchia AG, Sisci D, Pezzi V, Montanaro D, Musti AM, Picard D, Andos S (2004), "The G protein-coupled receptor GPR30 mediates upregulation by 17 beta-estradiol and phytoestrogens in breast cancer cells". The Journal of Biological Chemistry. 279 (26): 27008– 16.
29. Maggiolini M, Bonofiglio D, Marsico S, Panno ML, Cenni B, Picard D, Andos S (2001), "Estrogen receptor alpha mediates the proliferative but not the cytotoxic dose-dependent effects of two major phytoestrogens on human breast cancer cells". Molecular Pharmacology. 60(3): 595–602.
30. Matsuno H, Nakamura H, Katayama K, Hayashi S, Kano S, Yudoh K, Kiso Y (2009), ”Effects of an oral administration of glucosamine-chondroitin-quercetin glucoside on the synovial fluid properties in patients with osteoarthritis and rheumatoid arthritis”, Biosci. Biotechnol. Biochem.,73: 288-292.
31. Malgorzata Materska (2007), “Quercetin and its derivatives: Chemical structure and bioactivity” Polish Journal of Food and Nutririon Sciences. 58(4): 407 – 413. 32. SR, McAnulty LS, Nieman DC, Quindry JC, Hosick PA, Hudson MH, Still L,
Henson DA, Milne GL, Morrow JD, Dumke CL, Utter AC, Triplett NT (2008), “Chronic quercetin ingestion and exercise-induced oxidative damage and inflammation”, Appl. Physiol. Nutr. Metab., 33: 254-262.
33. Meena MC, Vidya P (2008), “Isolation and identification of flavonoid quercetin from Citrullus colocynthis (Linn.)”, Asian Journal of experimental science, 22(1): 137-142.
34. Moutsatsou P (2007). "The spectrum of phytoestrogens in nature: our knowledge is expanding". Hormones (Athens, Greece). 6 (3): 173–93.
35. Miles SL, McFarland M, Niles RM (2014), "Molecular and physiological actions of quercetin: need for clinical trials to assess its benefits in human disease". Nutrition Reviews. 72(11): 720–34.
36. Murakami A, Ashida H, Terao J (2008). "Multitargeted cancer prevention by quercetin". Cancer Letters. 269(2): 315–25.
37. Nicholson R and Vermerris W (2008), “Phenolic compound biochemistry”,
Springer, USA, 40; pp 151.
38. Pashevin DA, Tumanovska LV, Dosenko VE, Nagibin VS, Gurianova VL, Moibenko AA (2011), “Antiatherogenic effect of quercetin is mediated by proteasome inhibition in the aorta and circulating leukocytes”. Pharmacol. Rep., 63, pp.1009-1018.
39. Patel RM and Patel NJ (2011), “In vitro antioxidant activity of coumarin compounds by DPPH, Super oxide and nitric oxide free radical scavenging methods”, Journal of Advanced Pharmacy Education & Research, pp. 52-68 40. Peter C.H Hollman, André HM de Vries, Jeanne HM de Vries (1995),
“Absorption of dietary quercetin glycosides a quercetin in healthy ileostomy volunteers”, http://www.researchgate.net/publication/40152829.
41. Paolini M, Pozzentti L, Pedulli, GF, Marrchesi E, Cantelli FG (1999), “The nature of prooxidant activity of vitamin C”, Life science, 64, pp. 273-278. 42. Petrus K, Schwartz H, Sontag G (2011), "Analysis of flavonoids in honey by
HPLC coupled with coulometric electrode array detection and electrospray ionization mass spectrometry". Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400 (8): 2555–63.
43. Pietta PG (2000), “Flavonoids as antioxidants”, J Nat Prod, 63, pp.1035–1042. 44. Podmore ID, Griffiths H.R, Herbert K.E, Mistry N, Mistry P, Luneec J
(1998), ”Vitamin C exhibits pro-oxidant properties”, Nature, 392, pp.559 45. Prior RL and Cao G (2000), “Antioxidant phytochemicals in fruits and
vegetables:diet and health implications”, Hortic Sci, 35, pp.588–592.
46. Prossnitz ER, Barton M (2014), "Estrogen biology: new insights into GPER function andclinical opportunities". Molecular and Cellular Endocrinology. 389 (1-2): 71–83.
47. Quercetin biochemistry Encyclopædia Britannica.
48. Rodriguez GE, Carabias MR, Hernandez MJ, Revilla RP (2005), “Pressurized liquid extraction in the analysis of food and biological samples”, Journal of Chromatography A, 1089, pp. 1-17.
49. Russo GL, Russo M, Spagnuolo C, Tedesco I, Bilotto S, Iannitti R, Palumbo R (2014), bbd0%"Quercetin: a pleiotropic kinase inhibitor against cancer",Cancer
Treatment and Research. 159: 185–205.
50. Samuni A, Aronovitch J, Godinger D, Chevion M, Czapki G (1983), “On the cytotocicity of vitamin C and metal ions, a site specific Fenton mechanism”, Eur. J. Biochem., 137, pp. 119 -124.
51. Slimestad R, Fossen T, Vågen IM (2007), "Onions: a source of unique dietary flavonoids". Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55 (25): 10067–80. 52. Shaik YB, Castellani ML, Perrella A, Conti F, Salini V, Tete S, Madhappan B,
Vecchiet J, De Lutiis MA, Caraffa A, Cerulli G (2006), “Role of quercetin (a natural herbal compound) in allergy and inflammation”, J.Biol. Regul. Homeost.
Agents, 20, pp. 47-52.
53. Shoskes D.A; Zeitlin S.I, Shahed A, Rajfer J (1999), “Quercetin in men with category III chronic prostatitis: a preliminary prospective, double blinded, placebo controlled trial”, Urology, 54, pp. 960-963.
54. Sirichai A, Kasem S, Sophon R, Amorn P, Nattaya N, Warinthorn C, Sujitra D and Sirintorn D (2004), “Structure-actitivity relationship of trans-cinnamic acid derivatives on alpha-gucosidase inhibition”,Bioorganic and Medichinal
Chemistry Letters, 14, pp. 2893-2896.
55. Suh HJ, Lee JM, Cho JS, Kim YS, Chung SH (1999), “Radical scavenging compounds in onion skin”, Food Res. Int., 32, pp.659-664
56. Svendsen L, Rattan SI, Clark BF (1994), “Testing garlic for possible anti- ageing effects on long-term growth characteristics, morphology and macromolecular synthesis of humanfibroblasts in culture”, J. Ethnopharmacol., 43, pp. 125-133.
57. Tranchimand S, Brouant P, Iacazio G (2010), "The rutin catabolic pathway with special emphasis on quercetinase". Biodegradation. 21 (6): 833-59.
58. Tsan-Chang C, Hung-Der J, Wang-De L, Peng-Fu D, (2006), “Antioxidant and antimicrobial activities of commercial rice wine extracts of Taiwanese Allium fistulosum”, Food Chemistry, 190 , pp. 724 -729.
59. USDA Nutrient Data Laboratory (2011). USDA Database for the Flavonoid Content of Selected Foods. Beltsville, Md.: US. Dept. of Agriculture, http://www.ars.usda.gov/nutrientdata.
60. USDA Database for the Flavonoid Content of Selected Foods, Release 3 (PDF). U.S. Department of Agriculture. 2011.
61. US. National Library of Medicine, Open Chemistry Database, http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/5280343 (September 16, 2015).
62. Vuorelaa P, Leinonenb M, Saikkuc P, Tammelaa P, Rauhad JP, Wennberge T, Vuorela H, (2004), “Natural products in the process of finding new drug candidates”, Curr Med Chem, 11, pp.1375–1389.
63. Van der Woude H, Ter Veld MG, Jacobs N, van der Saag PT, Murk AJ, Rietjens IM (2005). "The stimulation of cell proliferation by quercetin is mediated by the estrogen receptor". Molecular Nutrition & Food Research. 49 (8): 763–71.
64. Williams ChA, Grayer RJ (2004), “Anthocyanins and other flavonoids”.
Nat. Prod. Rep., 21, pp. 539–573.
65. Winkel-Shirley B (2001), "Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology". Plant Physiology. 126 (2): 485–93.
66. Williams RJ, Spencer JP, Rice-Evans C (2004), "Flavonoids: antioxidants or signalling molecules?". Free Radical Biology & Medicine. 36 (7): 838–49.
Barnes S, Prasain J, D'Alessandro T, Arabshahi A, Botting N, Lila MA, Jackson G, Janle EM, Weaver CM (May 2011), "The metabolism and analysis of isoflavones and other dietary polyphenols in foods and biological systems".