2.2.1. Loại albumin và IgG huyết thanh bằng “Aurum™Serum Protein Mini Kit” Kit”
Chuẩn bị mẫu
Các mẫu huyết thanh của 30 bệnh nhân mắc hội chứng mạch vành cấp lần lƣợt đƣợc pha loãng trong các ống Eppendorf với đệm Binding theo tỉ lệ 1 : 3 (60 µl huyết thanh : 180 µl đệm).
Chuẩn bị cột
Mở nắp, loại bỏ lớp nhựa bên dƣới, cho vào ống Test, li tâm 10.000g, 20 giây để loại bỏ dịch bảo quản.
Thêm 200 µl đệm Binding, để đệm chạy qua cột theo lực trọng trƣờng. Lặp lại hai lần để rửa cột.
Loại bỏ dung dịch đệm Binding đã qua cột.
Đặt cột vào một ống Eppendorf khác để chạy mẫu.
Huyết thanh Loại albumin & IgG Tủa lạnh bằng
acetone
SDS-PAGE và cắt băng
Thủy phân trong gel bằng trypsin Phân tích LC-
Loại bỏ Albumin & IgG
Đƣa 200 µl mẫu đã pha loãng vào cột đã đƣợc chuẩn bị và cho chảy qua chất giá theo lực trọng trƣờng.
Mix nhẹ cột, để yên trong khoảng 5 phút đến 10 phút, sau đó lặp lại bƣớc này hai lần.
Để yên cột trong 10 phút rồi đem li tâm 10.000g, 20 giây.
Tiếp theo, rửa cột với 200 µl đệm Binding trong và thu lấy phần dịch rửa, phần dịch này trộn với phần mẫu thu đƣợc ở trên.
Dung dịch đã loại albumin và IgG sau khi qua cột đƣợc bảo quản ở tủ -25ºC đến khi sử dụng cho các bƣớc thí nghiêm tiếp theo.
Một phần dịch không bám cột đƣợc sử dụng để điện di SDS-PAGE kiểm tra kết quả loại albumin và IgG.
2.2.2. Xác định hàm lƣợng protein và tủa để tinh sạch mẫu
Hàm lƣợng protein của mẫu đƣợc xác định theo phƣơng pháp Bradford với thuốc nhuộm Quick Start Bradford Dye Regent 1x (Bio-Rad, Hercules, Hoa Kì). Mẫu đƣợc pha lỗng với tỉ lệ thể tích 1: 50 và trộn đều với thuốc thử của phản ứng theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất: 20 µl mẫu trộn với 980 µl thuốc nhuộm, ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Mẫu đƣợc đo ở bƣớc sóng 595 nm, thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần, sử dụng BSA chuẩn với các nồng độ khác nhau (từ 0,125mg/ml đến 2mg/ml) để xây dựng đƣờng chuẩn. Sau khi xác định phƣơng trình đƣờng chuẩn, tính tốn nồng độ thực của mẫu theo tỉ lệ pha lỗng.
Sau đó, tinh sạch mẫu bằng cách tủa mẫu trong acetone 100% ở -25oC qua đêm
theo tỉ lệ 1 thể tích mẫu : 4 thể tích aceton. Sau khi tủa xong, tiến hành li tâm 13000 vòng/phút trong 30 phút. Loại bỏ dịch nổi, thu tủa protein dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.3. Điện di gel polyacrylamide có SDS (SDS-PAGE)
Quy trình SDS-PAGE đƣợc thực hiện để phân tách mẫu nghiên cứu thành các nhóm có khối lƣợng phân tử khác nhau. Điều này sẽ giúp làm giảm độ phức tạp của mẫu trong các phân tích tiếp theo. Hơn nữa, qua kết quả điện di ta cịn có thể xác định đƣợc độ tinh sạch của mẫu qua các bƣớc xử lí trƣớc đó để có biện pháp khắc phục các hiện tƣợng không mong muốn. Protein sau tủa đƣợc hịa tan và biến tính trong 15 µl đệm Sample (25% (v/v) glycerol; 14,4 mM 2-mercapto ethanol; 2%
(w/v) SDS; 0,1% (w/v) bromophenol blue; 60 mM 1M Tris-Cl pH 6,8) ở 980C, 10
phút. Cuối cùng, mẫu đƣợc phân tách trên gel polyacrylamide với thành phần theo nhƣ Bảng 2 (thể tích đƣợc tính cho một bản gel). Bảng 2. Các thành phần tạo gel Loại gel Thành phần Nồng độ Thể tích Gel cơ 5% (Stacking gel) H2O 1,3 ml Tris-HCl pH 6,8 0,5 M 0,5 ml Acrylamide 30% (w/v) 0,35 ml SDS 10% (w/v) 10 µl APS 10% (w/v) 20 µl TEMED 100% 2 µl Gel chạy 12,6% (Running gel) H2O 0,55ml Tris-HCl pH 8,8 1,5 M 1,125 ml Glycerol 50% (v/v) 0,9 ml Acrylamide 30% (w/v) 1, 89 ml SDS 10% (w/v) 45 µl APS 10% (w/v) 30 µl TEMED 100% 3 µl
Q trình điện di đƣợc thực hiện dƣới hiệu điện thế không đổi 120V. Kết thúc điện di, bản gel đƣợc nhuộm bằng dung dịch Coomassie Brilliant Blue G250 (0,1% (w/v) Coomassie Brilliant Blue; 30% (v/v) methanol; 10% (v/v) acid acetic) trong 120 phút. Bản gel đƣợc tẩy nền bằng dung dịch tẩy (30% (v/v) methanol; 10% (v/v) acid acetic) cho đến khi có thể quan sát thấy các băng protein hiện rõ nét trên nền gel. Tiến hành chụp các bản gel bằng máy laser Bio-Rad FX dƣới sự hỗ trợ của
phần mềm phân tích hình ảnh. Phần mềm sẽ ƣớc lƣợng hàm lƣợng protein trong từng giếng điện di bằng cách đo độ tƣơng phản trên hình ảnh điện di. Sau đó, các giếng điện di sẽ đƣợc phân chia thành các phân đoạn có hàm lƣợng protein xấp xỉ nhau. Cuối cùng, các phân đoạn sẽ đƣợc cắt rời khỏi bản gel dùng cho bƣớc thủy phân tiếp theo.
2.2.4. Thủy phân protein bằng trypsin trong gel
Các phân đoạn protein biểu hiện trên bản điện di SDS-PAGE đƣợc cắt ra từ bản gel polyacrylamide và chuyển vào ống Eppendorf 1,5 ml. Gel đƣợc rửa, loại thuốc nhuộm bằng dung dịch rửa (50 mM NH4HCO3 pH 8 ; 50% ACN). Sau đó, các mảnh gel đƣợc làm khơ bằng 100% ACN và khử bằng DTT với dung dịch khử chứa
5 mM DTT ở 56 0C trong 1h. Sau khi khử, gel đƣợc alkyl hóa bằng IAA với dịch
chứa 5 mM IAA trong tối, 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Enzyme trypsin (loại sử dụng cho đọc trình tự, Sigma-Aldrich, Hoa Kì) đƣợc thêm vào với tỉ lệ enzyme : cơ chất là 1 : 50, ở 370C trong 16 giờ. Sau khi thủy phân, các peptide đƣợc chiết ra khỏi gel bằng dung dịch chiết chứa 50% ACN; 0,1% FA và siêu âm 20 phút. Quá trình chiết peptide khỏi gel đƣợc lặp lại ba lần.
2.2.5. Sắc kí đa chiều và phân tích khối phổ
Hỗn hợp peptide sau khi thủy phân trong trong gel đƣợc hòa vào FA 1% và phân tích trên hệ sắc kí lỏng Nano. Đối với hỗn hợp peptide phức tạp tạo ra do thủy phân protein trong các phân đoạn gel, tiến hành chạy 2 chiều (qua cột trao đổi ion SCX và cột RP C18) với 16 phân đoạn, 60 phút/mỗi phân đoạn.
Hệ sắc kí lỏng nano
Các loại cột với đƣờng kính mức m đƣợc sử dụng cho hệ NanoLC theo nguyên lý ngƣợc pha C18 (75 m x 15 cm), hoặc trao đổi ion SCX (500 m x 1,5 cm),
đƣờng kính dây nối là 20 m.
Các peptide đƣợc phân tách theo chiều thứ nhất trên cột sắc kí trao đổi ion SCX (LC Parking, Dionex, Hoa Kì) bằng các chất trao đổi cation mạnh. Peptide đƣợc đƣa vào với thể tích 20 l thơng qua hệ đƣa mẫu tự động và đƣợc đƣa lên cột SCX (500 m x 15 mm) với tốc độ dòng 30 l/phút bằng 0,1% FA. Các peptide bám trên
cột SCX đƣợc thôi ra bằng 16 phân đoạn muối CH3COONH4 có nồng độ từ 0 đến
1M. Peptide thôi ra từ cột SCX đƣợc cô đặc và loại muối trên cột ngƣợc pha (300
m x 1,5 cm) trƣớc khi phân tách trên cột RP-C18 với chiều dài 15 cm. Sắc ký
chiều thứ hai đƣợc thực hiện trên cột ngƣợc pha C18 15 cm với pha linh động A (0,1% FA) và B (0,1% FA trong 85% ACN). Các peptide đƣợc thôi ra với tốc độ dòng là 0,2 l/phút theo gradient tuyến tính từ 5-100% dung dịch B trong 60 phút. Các phân tích khối phổ đƣợc thực hiện sử dụng hệ thống QSTARXL MS/MS (Applied Biosystems/MDS Sciex, Ontario, Canada) đƣợc trang bị với nguồn ion hóa bằng phun điện (ESI).
Ghi phổ NanoLC-ESI- MS/MS
Máy khối phổ QSTARXL đƣợc vận hành ở chế độ Information Dependent
Acquisition để thực hiện việc chuyển từ quét phổ TOF MS đơn đối với các ion nằm trong dải khối từ 400 amu đến 1200 amu sang khối phổ liên tiếp (MS/MS) trên 3 ion phân tử có mật độ cao nhất và lớn hơn 20 đƣợc xác định tự động nhờ phần mềm BioAnalyst QS phiên bản 1.1 (Applied Biosystems, Hoa Kì). Sai số về khối đƣợc đặt ở mức ± 0,25 Da, thời gian không thực hiện lại MS/MS đối với một mảnh là 90 giây. Hiệu điện thế đƣợc đặt ở nguồn để ion hóa mẫu là 2200V.